巨噬細(xì)胞在沙門(mén)菌感染中作用的研究新進(jìn)展

王貝貝，吳淑燕，黃瑞

蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院病原生物學(xué)系，蘇州 215123

巨噬細(xì)胞(macrophage)是由血液中的單核細(xì)胞進(jìn)入組織器官分化而成。作為機(jī)體天然免疫的重要細(xì)胞，巨噬細(xì)胞對(duì)感染可發(fā)生迅速反應(yīng)，既能直接吞噬、殺傷病原體而發(fā)揮非特異性免疫應(yīng)答作用，又能參與抗原的攝取、加工、處理并呈遞給T輔助細(xì)胞(T helper，Th細(xì)胞)，啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答，從而將天然免疫與適應(yīng)性免疫聯(lián)系起來(lái)，在抗感染免疫中具有非常重要的作用。機(jī)體感染后，一方面沙門(mén)菌作為兼性胞內(nèi)菌，被巨噬細(xì)胞吞噬、殺傷；另一方面，以巨噬細(xì)胞作為庇護(hù)場(chǎng)所，抵抗藥物、抗體及機(jī)體非特異性免疫分子如補(bǔ)體、溶菌酶和防御素等的殺傷。

1 巨噬細(xì)胞活化對(duì)沙門(mén)菌的清除

巨噬細(xì)胞作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞，處于靜息或非活化狀態(tài)時(shí)并無(wú)殺傷作用。在組織微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞的激活受多種因素影響，如入侵病原體的菌體成分及其產(chǎn)物、細(xì)胞因子、植物血凝素、寄生蟲(chóng)等的刺激，都會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞活化并作出迅速應(yīng)答[1]?；罨蟮木奘杉?xì)胞分化為2個(gè)不同亞群：M1和M2。M1即經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(classically activated macrophage，CAM)，主要通過(guò)干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)和細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)活化，具有吞噬殺菌、釋放炎癥介質(zhì)、呈遞抗原和啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的功能，是機(jī)體抵御外來(lái)物質(zhì)的重要防線。M2即替代性活化的巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophage，AAM)。由于活化的誘導(dǎo)物質(zhì)不同，細(xì)胞表面亦出現(xiàn)不同的活化標(biāo)記而再分為3個(gè)亞群：M2a，由白細(xì)胞介素4(interleukin 4，IL-4)或IL-13誘導(dǎo)，具有抗炎作用；M2b，由免疫復(fù)合物和部分Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)或白細(xì)胞介素1受體(interleukin 1 receptor，IL-1R)的激動(dòng)劑誘導(dǎo)，具有抗原呈遞作用；M2c，由IL-10和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)，具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用和組織修復(fù)能力，但殺滅微生物的功能很弱。

Chakravortty等證明，沙門(mén)菌致病島2(Salmonellapathogenicity island 2，SPI2)可阻止亞硝酸鹽在未活化巨噬細(xì)胞的含沙門(mén)菌囊泡(Salmonella-containing vacuole，SCV)中積累，從而使細(xì)菌在巨噬細(xì)胞中存活[2]。SPI2在巨噬細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)依賴(lài)反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白PhoP。當(dāng)巨噬細(xì)胞被IFN-γ激活后，PhoP及組氨酸蛋白激酶PhoQ (PhoP-PhoQ)的活性可被高濃度的活性氮中間產(chǎn)物(reactive nitrogen intermediate，RNI)抑制，導(dǎo)致SPI2表達(dá)受抑，促進(jìn)SCV成熟，并與溶酶體融合后殺傷入侵細(xì)菌[3]。

巨噬細(xì)胞對(duì)控制和清除宿主細(xì)胞中的沙門(mén)菌非常重要。當(dāng)病原體入侵時(shí)，巨噬細(xì)胞自身及其產(chǎn)物所共有的某些高度保守的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，被巨噬細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)識(shí)別，進(jìn)而將其攝入胞內(nèi)形成吞噬小體(phagosome)。后者進(jìn)一步與胞內(nèi)溶酶體融合，形成吞噬溶酶體(phagolysosome)后通過(guò)氧依賴(lài)性和非氧依賴(lài)性途徑等方式消化和清除病原體。此外，細(xì)胞因子也發(fā)揮極其重要的作用。沙門(mén)菌及其產(chǎn)物能增加巨噬細(xì)胞中mRNA表達(dá)，使其分泌多種細(xì)胞因子，如炎癥細(xì)胞因子IL-1，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)，IL-6、趨化因子如炎性蛋白1α(inflammatory protein 1α，MIP-1α)、MIP-1β、MIP-2α，以及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)。

在氧依賴(lài)性途徑中，活性氧中間產(chǎn)物(reactive oxygen intermediate，ROI)和RNI是2個(gè)主要的效應(yīng)分子。ROI由吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶產(chǎn)生，RNI由NOS2基因編碼的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)產(chǎn)生。ROI可介導(dǎo)病原體快速清除，且與巨噬細(xì)胞早期殺傷沙門(mén)菌有關(guān)。在沙門(mén)菌感染早期，主要是依賴(lài)NADPH氧化酶在吞噬小體中的定位控制其生長(zhǎng)。當(dāng)TNF-α與腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)p55結(jié)合活化受體后，ROI對(duì)胞內(nèi)菌的殺傷能力增強(qiáng)。在沙門(mén)菌感染后期，NOS2依賴(lài)性的RNI產(chǎn)物在限制細(xì)菌生長(zhǎng)中起重要作用。NOS2受IFN-γ、IL-12和IL-18等細(xì)胞因子的刺激，表達(dá)量顯著增加[4]。IL-12是由p35和p40兩個(gè)亞基組成的異源二聚體。沙門(mén)菌感染可導(dǎo)致IL-12 p40在派爾伊結(jié)(Peyer)、腸系膜淋巴結(jié)、脾和肝中的表達(dá)量顯著上升，而IL-12 p35的表達(dá)不受影響[5]。IL-12的另一個(gè)重要作用是誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞(natural killer，NK細(xì)胞)和T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，激活巨噬細(xì)胞呈遞抗原和殺菌的能力。IFN-γ可調(diào)節(jié)單核-巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)TNF-α和IL-12釋放，形成級(jí)聯(lián)瀑布效應(yīng)。IL-18是Th1型細(xì)胞因子，在宿主抵御沙門(mén)菌感染中發(fā)揮重要作用。用抗體中和IL-18可導(dǎo)致動(dòng)物脾和肝中細(xì)菌數(shù)量增加，宿主存活率降低。用IL-18干預(yù)后，脾和肝中細(xì)菌數(shù)量降低，宿主存活率上升[6]。與IL-12一樣，IL-18可誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生，通過(guò)激發(fā)IFN-γ分泌促進(jìn)Th1型細(xì)胞增殖，進(jìn)一步誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β和IL-8等細(xì)胞因子產(chǎn)生，增強(qiáng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和抗感染的能力。此外，鼠傷寒沙門(mén)菌可刺激巨噬細(xì)胞分泌IL-10，不僅可抑制細(xì)胞的殺菌作用，還可為該菌在細(xì)胞中增殖提供良好的宿主環(huán)境[7]。

目前，越來(lái)越多的研究報(bào)道沙門(mén)菌可通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡而逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別，導(dǎo)致機(jī)體持續(xù)性感染。例如，當(dāng)巨噬細(xì)胞感染了表達(dá)Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system，TTSS)的沙門(mén)菌，會(huì)因被誘導(dǎo)凋亡而無(wú)法將其加工處理的抗原呈遞給T細(xì)胞，但凋亡的巨噬細(xì)胞可作為沙門(mén)菌抗原的貯存庫(kù)。旁觀樹(shù)突細(xì)胞(dendritic cell，DC)通過(guò)攝取巨噬細(xì)胞凋亡物質(zhì)和菌體成分，以主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)分子的形式呈遞給T細(xì)胞。有趣的是，充當(dāng)旁觀抗原呈遞細(xì)胞似乎是DC的一個(gè)獨(dú)特功能，巨噬細(xì)胞只能攝取沙門(mén)菌誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞，而不能呈遞沙門(mén)菌抗原多肽[8]。而Guiney等認(rèn)為，沙門(mén)菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡是一種特殊的毒力機(jī)制，可促進(jìn)細(xì)菌在細(xì)胞間傳播[9]。凋亡的發(fā)生改變了細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)，從而使受體介導(dǎo)的周?chē)奘杉?xì)胞啟動(dòng)對(duì)凋亡細(xì)胞的攝取，導(dǎo)致細(xì)菌在巨噬細(xì)胞間不斷擴(kuò)散和感染。但適度誘導(dǎo)自噬可降低巨噬細(xì)胞凋亡率。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，自噬誘導(dǎo)劑西羅莫司〔雷帕霉素(rapamycin，RAPA)〕干預(yù)鼠傷寒沙門(mén)菌感染的小鼠巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞自噬程度增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)活菌數(shù)及其所致的巨噬細(xì)胞凋亡率明顯降低，提示調(diào)控細(xì)胞的自噬水平可降低宿主凋亡率，有利于增強(qiáng)機(jī)體抗感染能力[10]。此外，天冬氨酸半胱氨酸特異性蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific protease 1, caspase-1)的活化也可抑制沙門(mén)菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡，它可啟動(dòng)細(xì)胞pyroptotic樣死亡，分泌促炎癥細(xì)胞因子IL-1β和IL-18, 通過(guò)招募和激活免疫細(xì)胞有效清除胞內(nèi)病原菌[11]。Pyroptotic是一種促進(jìn)炎癥的細(xì)胞死亡程序，可應(yīng)對(duì)多種威脅，包括代謝應(yīng)激和細(xì)菌感染等，具有快速損壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞溶解并釋放促炎物質(zhì)的特點(diǎn)。

2 巨噬細(xì)胞作為沙門(mén)菌感染的宿主

沙門(mén)菌是一種兼性胞內(nèi)菌，侵入機(jī)體后主要寄居在單核-巨噬細(xì)胞中。沙門(mén)菌有毒株能侵襲小腸黏膜，經(jīng)回腸黏膜上M細(xì)胞(microfold cell)進(jìn)入機(jī)體。其步驟是細(xì)菌黏附、細(xì)胞肌動(dòng)蛋白重排和內(nèi)在化、細(xì)菌在吞噬泡內(nèi)繁殖釋放并再次被固有層中的巨噬細(xì)胞吞噬，如此循環(huán)往復(fù)。沙門(mén)菌的黏附和入侵由染色體中的侵襲素基因inv介導(dǎo)。

沙門(mén)菌導(dǎo)致的系統(tǒng)性感染依賴(lài)于在專(zhuān)職吞噬性細(xì)胞中存活的能力。這個(gè)過(guò)程是復(fù)雜的，包括改變細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)以抵抗天然免疫的破壞，感知宿主的吞噬體環(huán)境，通過(guò)吞噬小體重塑而使宿主形成有利于細(xì)菌增殖的胞內(nèi)環(huán)境等。沙門(mén)菌對(duì)機(jī)體的毒力主要由2種TTSS介導(dǎo)，分別由SPI1和SPI2編碼，通過(guò)分泌蛋白或直接將毒力蛋白注入宿主細(xì)胞發(fā)揮致病作用。一旦細(xì)菌毒力蛋白進(jìn)入胞內(nèi)，宿主細(xì)胞功能如細(xì)胞骨架、膜運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞因子基因表達(dá)等發(fā)生改變，以利于細(xì)菌在其中生存和增殖。盡管TTSS高度保守，但這2個(gè)系統(tǒng)的效應(yīng)蛋白卻是獨(dú)一無(wú)二的。2種分泌系統(tǒng)都與細(xì)菌胞內(nèi)增殖有關(guān)，SPI1編碼的TTSS在細(xì)菌侵襲的初始階段發(fā)揮重要作用，可通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞前炎癥因子表達(dá)[12]、誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重排啟動(dòng)大胞飲等作用，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌侵襲，是多種動(dòng)物和人類(lèi)胃腸炎的重要致病因素[13]。SPI2編碼的TTSS及其效應(yīng)蛋白與沙門(mén)菌的系統(tǒng)感染有關(guān)，它可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)菌在胞內(nèi)轉(zhuǎn)移、抑制吞噬體成熟和抵御宿主殺傷機(jī)制等方式，確保細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存和生長(zhǎng)[14]。SPI2按基因結(jié)構(gòu)功能分成兩部分：一部分包含編碼雙組分調(diào)控系統(tǒng)的基因(ssrA和ssrB)、編碼TTSS的結(jié)構(gòu)成分基因ssa、效應(yīng)蛋白基因sse和伴侶蛋白基因ssc；另一部分包含編碼連四硫酸鹽還原酶的基因(ttrA、ttrB、ttrC)和雙組分調(diào)控系統(tǒng)基因(ttrR、ttrS)，與沙門(mén)菌的系統(tǒng)性感染無(wú)直接關(guān)系。研究表明，SsrB是沙門(mén)菌毒力基因的重要調(diào)節(jié)子，且SsrB能激活srfN基因，并直接控制其在細(xì)胞內(nèi)的感染[15]。SseA是SPI2依賴(lài)性轉(zhuǎn)移蛋白SifA和PipB所必需的，SifA與沙門(mén)菌在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的生存和復(fù)制密切相關(guān)。SpiC蛋白可干擾SCV在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)并阻止其與溶酶體融合，從而避開(kāi)胞內(nèi)降解途徑。而spiC突變后再感染巨噬細(xì)胞時(shí)，細(xì)菌致病性及生存能力大大降低[16]。

此外，沙門(mén)菌能感知宿主的胞質(zhì)pH值，SPI2編碼的TTSS pH傳感器在中性環(huán)境中構(gòu)象發(fā)生改變，引起SsaM/SpiC/SsaL調(diào)控復(fù)合物降解，從而導(dǎo)致效應(yīng)蛋白易位，而酸性環(huán)境可防止復(fù)合物降解和效應(yīng)蛋白易位[17]。不僅如此，Lee等最新研究發(fā)現(xiàn)，宿主細(xì)胞的酸性環(huán)境還可引發(fā)胞質(zhì)ATP水平上升，而ATP含量變化激活沙門(mén)菌毒力基因，促進(jìn)毒力蛋白表達(dá)，從而使沙門(mén)菌在宿主中得以存活[18]。

除致病島外，沙門(mén)菌的其他毒力基因?qū)ζ湓诰奘杉?xì)胞內(nèi)的進(jìn)一步生存也很重要，如攜帶spv基因的沙門(mén)菌不僅能抵抗和逃逸宿主的免疫防御，還能通過(guò)抑制自噬、促進(jìn)凋亡而加重感染[19]。另一種調(diào)節(jié)基因tdcA突變后，會(huì)影響鞭毛和PhoP調(diào)節(jié)蛋白，使沙門(mén)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活數(shù)量下降[20]。脂質(zhì)A的變構(gòu)對(duì)于沙門(mén)菌在胞內(nèi)生存也至關(guān)重要。脂質(zhì)A鈍化酶LpxR可通過(guò)3′-O-脫酰作用對(duì)其進(jìn)行修飾，從而降低其毒力，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)的LpxR缺陷株數(shù)量明顯低于野生株。此外, 當(dāng)感染LpxR缺陷菌株時(shí)，它還可增強(qiáng)胞內(nèi)iNOS表達(dá)水平，說(shuō)明脂質(zhì)A的3′-O-脫酰作用促進(jìn)沙門(mén)菌在胞內(nèi)生長(zhǎng)[21]。

3 結(jié)語(yǔ)

沙門(mén)菌作為一種兼性胞內(nèi)菌，在宿主體內(nèi)主要寄居在單核-巨噬細(xì)胞內(nèi)。在與宿主細(xì)胞長(zhǎng)期相互作用的過(guò)程中，沙門(mén)菌已進(jìn)化出一套精密的調(diào)控系統(tǒng)，不但具備抵抗溶酶體酶、抑制吞噬體-溶酶體融合、干擾ROI等逃避巨噬細(xì)胞殺傷的防御機(jī)制，而且可以巨噬細(xì)胞作為感染過(guò)程中的宿主，在細(xì)胞內(nèi)形成SCV。這不僅有利于細(xì)菌存活，還可有效逃避宿主的免疫應(yīng)答。因此，更深入了解巨噬細(xì)胞在沙門(mén)菌感染過(guò)程中的作用，將有助于探索沙門(mén)菌所致疾病的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸，同時(shí)為預(yù)防和治療提供新的思路和對(duì)策。

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