對(duì)乙型肝炎病毒耐核苷(酸)類(lèi)似物機(jī)制的新認(rèn)識(shí)

范志遠(yuǎn)，于德敏，張欣欣

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院瑞金臨床醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，上海 200025； 2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院感染科，上海 200025

抗病毒是目前治療慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)的重要手段，主要藥物有干擾素類(lèi)和核苷(酸)類(lèi)似物，后者包括L-核苷(酸)類(lèi)的拉米夫定(lamivudine，LAM)和替比夫定(telbivudine，LdT)、無(wú)環(huán)磷酸鹽類(lèi)的阿德福韋酯(adefovir dipivoxil，ADV)和替諾福韋酯(tenofovir disoproxil fumarate，TDF)、環(huán)戊烷/烯類(lèi)的恩替卡韋(entecavir，ETV)[1]。核苷(酸)類(lèi)藥物因具口服方便、不良反應(yīng)少、應(yīng)答率高等優(yōu)點(diǎn)而廣泛使用，但主要缺點(diǎn)是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)對(duì)部分核苷(酸)類(lèi)藥物累積耐藥的發(fā)生率較高，且需長(zhǎng)期甚至終身服藥。現(xiàn)就近年來(lái)有關(guān)CHB治療中HBV對(duì)核苷(酸)類(lèi)似物耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展作一綜述。

1 對(duì)核苷(酸)類(lèi)藥物耐藥通路的新認(rèn)識(shí)

1.1 M204I/V通路

有關(guān)研究表明，YMDD突變(rtM204I/V)相關(guān)通路或稱(chēng)M204I/V通路是HBV對(duì)L-核苷(酸)類(lèi)藥物耐藥的主要通路，與其他藥物無(wú)明顯相關(guān)性[2]。但M204I/V并非HBV耐LAM的唯一通路，也并非只在HBV耐LAM中起作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，L80I、V173L、A181V/T等通路亦可作為HBV對(duì)LAM耐藥的通路[3-6]。另外的研究則顯示，M204V 通路與HBV耐ETV相關(guān)[7]，M204I通路則與HBV耐LdT相關(guān)，且為HBV耐LdT主要通路[8]。

因此，M204I/V通路是HBV對(duì)LAM、ETV、LdT發(fā)生交叉耐藥的重要通路，即一旦HBV對(duì)LAM產(chǎn)生耐藥，用ETV及LdT替代治療也可能面臨失敗。

1.2 L180M、V173L與L80V/I通路

已有研究表明，rtL180M、rtV173L及rtL80V/I突變往往并不單獨(dú)存在，而是伴隨rtM204I/V突變出現(xiàn)，且這些突變通常起代償作用，可恢復(fù)HBV DNA聚合酶因rtM 204I/V突變而降低的復(fù)制適應(yīng)性[9]。另2項(xiàng)研究[10,11]也顯示，rtM204I/V與rtL180M、rtL80V/I在HBV對(duì)L-核苷(酸)類(lèi)藥物耐藥發(fā)生中有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。

據(jù)目前研究，L180M、V173L、L80V/I這3條通路的主要作用是對(duì)M204I/V通路起代償補(bǔ)充作用，協(xié)助M204I/V通路在HBV對(duì)L-核苷(酸)類(lèi)藥物耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

1.3 N236T與I233V通路

Angus等[12]及Hadziyannis等[13]均在ADV治療期間發(fā)生臨床耐藥的患者HBV中發(fā)現(xiàn)了rtN236T和rtA181V/T突變，且兩者與HBV耐ADV明顯相關(guān)。另外，Osiowy等于2006年的研究也得出類(lèi)似結(jié)論[14]。這些研究提示，HBV耐ADV的發(fā)生與N236T、A181V/T通路密切相關(guān)。

rtI233V是發(fā)生于rtN236T附近233位點(diǎn)上的一個(gè)突變，目前對(duì)該突變的功能意義知之甚少。之前有研究顯示，rtI233V也可能在HBV耐ADV中發(fā)揮一定作用[15]。然而，I233V通路與HBV耐ADV是否確切相關(guān)尚有待進(jìn)一步證實(shí)。

1.4 A181V/T通路

如前所述，A181V/T通路與HBV對(duì)ADV耐藥發(fā)生相關(guān)。Zoulim等于2008年的一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，181位點(diǎn)的突變?cè)贖BV對(duì)LAM和ADV耐藥發(fā)生中起重要作用[16]。Locarnini 在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步指出[17]，A181V/T通路為HBV對(duì)所有核苷(酸)類(lèi)藥物耐藥共有的原發(fā)性通路。可見(jiàn)，A181V/T通路是一條非特異的通路。

1.5 其他耐藥通路

除上述幾條主要耐藥通路外，V84M/S85A、A194T、V214A/Q215S、P237H、N238D、I169T、T184G/S、S202I、M250V等通路也相繼報(bào)道，這些通路大多為繼發(fā)性耐藥通路。其中，V84M/S85A、P237H和N238D通路被認(rèn)為與HBV耐ADV的發(fā)生相關(guān)， A194T通路與HBV耐TDF的發(fā)生相關(guān)，T184G、S202I和M250V通路與HBV耐ETV的發(fā)生相關(guān)，I169T、T184S通路與HBV對(duì)LAM和ETV的交叉耐藥相關(guān)，V214A/Q215S通路則與HBV對(duì)LAM和ADV的交叉耐藥相關(guān)[18]。但關(guān)于這些通路的具體臨床意義，目前認(rèn)識(shí)仍不多。

1.6 對(duì)耐藥通路的綜合認(rèn)識(shí)

Locarnini于2008年綜合了現(xiàn)有HBV耐藥通道研究成果，將HBV主要耐藥通路總結(jié)為五大類(lèi)[17]：M204I/V、N236T、A181V/T、A181V/T+N236T和L180M+M204I/V±I169T±T184G±S202I±M250V。他進(jìn)一步指出，M204I/V是HBV對(duì)L-核苷(酸)類(lèi)藥物的主要耐藥通路；N236T是HBV對(duì)ADV耐藥的主要通路；A181V/T通路是HBV對(duì)所有核苷(酸)類(lèi)藥物耐藥共有的原發(fā)性通路，為重要的交叉耐藥通路，且HBV僅對(duì)ETV敏感；HBV對(duì)ADV和TDF可通過(guò)A181V/T和N236T雙重通路發(fā)生耐藥；HBV可通過(guò)僅包含多重耐藥位點(diǎn)置換的L180M+M204I/V±I169T±T184G±S202I±M250V通路對(duì)ETV耐藥[7]。

對(duì)耐藥通路的新認(rèn)識(shí)為臨床合理選用高基因屏障抗病毒藥物、預(yù)防HBV交叉耐藥的發(fā)生提供了重要指導(dǎo)意義。

2 對(duì)核苷(酸)類(lèi)藥物耐藥的分子機(jī)制研究

除上述對(duì)HBV耐藥通路的認(rèn)識(shí)外，有關(guān)耐藥發(fā)生的分子機(jī)制也有較多研究報(bào)道。HBV DNA聚合酶同源反轉(zhuǎn)錄酶三維立體分子模型的構(gòu)建為闡明這些過(guò)程的分子機(jī)制提供了很多參考。

2.1 對(duì)L-核苷(酸)類(lèi)藥物耐藥的分子機(jī)制

分子模型研究表明，發(fā)生rtM204I/V突變后，HBV DNA聚合酶上結(jié)合dNTP的袋狀結(jié)構(gòu)的大小及電荷分布均發(fā)生改變， LAM與聚合酶間的空間阻力和靜電斥力增加，導(dǎo)致兩者結(jié)合能力下降，最終導(dǎo)致對(duì)LAM耐藥；發(fā)生rtL180M突變后，HBV DNA聚合酶與三磷酸拉米夫定氧硫雜環(huán)的親和力降低，增加該酶脫氧核糖結(jié)合位點(diǎn)的局部負(fù)電荷，使其對(duì)LAM與dCTP的鑒別力增強(qiáng)，保證了DNA復(fù)制的可靠性；而位于HBV反轉(zhuǎn)錄活性中心附近模板鏈上的173位點(diǎn)發(fā)生rtV173L突變后，聚合酶的聚合效率因復(fù)制模板和(或)催化中心結(jié)構(gòu)發(fā)生調(diào)整而增強(qiáng)[4,19-21]。

上述研究從分子水平揭示了rtM204I/V、rtL180M及rtV173L突變?nèi)绾卧贖BV對(duì)LAM耐藥發(fā)生中起作用。需指出的是，這些研究目前都主要集中在HBV對(duì)LAM耐藥分子機(jī)制的研究，對(duì)其他L-核苷(酸)類(lèi)藥物如LdT的類(lèi)似研究少有報(bào)道。但目前已有科學(xué)家基于活體內(nèi)HBV對(duì)LAM耐藥也會(huì)對(duì)其他L-核苷(酸)類(lèi)藥物產(chǎn)生高水平的交叉耐藥，以及對(duì)其他L-核苷(酸)類(lèi)藥物耐藥由rtM204I/V引起這2個(gè)現(xiàn)象，提出HBV對(duì)其他L-核苷(酸)類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制可能與LAM相類(lèi)似的假設(shè)[22]，這有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

2.2 對(duì)無(wú)環(huán)磷酸鹽類(lèi)藥物耐藥的分子機(jī)制

在研究ADV耐藥的分子模型中發(fā)現(xiàn)，野毒株聚合酶N236在D區(qū)可以與rtS85及ADV的γ-磷酸基團(tuán)各形成1個(gè)氫鍵，使ADV發(fā)揮抑制病毒復(fù)制的效應(yīng)。而發(fā)生rtN236T突變后，這2個(gè)氫鍵受破壞， ADV與聚合酶間的靜電作用力大大減弱，以致聚合酶對(duì)ADV的敏感度顯著降低，使HBV對(duì)ADV耐藥。rtA181V/T突變則可通過(guò)B區(qū)活性中心外的變構(gòu)效應(yīng)引起催化部位構(gòu)象改變，達(dá)到類(lèi)似效果[16]。這些研究進(jìn)一步指出，空間上與rtN236T鄰近的rtP237H、rtN238T/D、rtV84M、rtS85A等突變位點(diǎn)也可能以類(lèi)似方式在HBV對(duì)ADV耐藥發(fā)生中起作用。HBV對(duì)TDF耐藥的分子模型研究表明，rtA194T可通過(guò)變構(gòu)效應(yīng)影響復(fù)制模板與dNTP的結(jié)合而導(dǎo)致HBV對(duì)TDF耐藥[23]。

雖然上述機(jī)制能解釋聚合酶發(fā)生相應(yīng)改變的HBV對(duì)ADV耐藥的原因，但在ADV治療失敗的患者中只有少數(shù)檢測(cè)到聚合酶的相應(yīng)改變[24]，提示尚存在其他HBV耐ADV分子機(jī)制。

2.3 對(duì)環(huán)戊烷/烯類(lèi)藥物耐藥的分子機(jī)制

環(huán)戊烷/烯類(lèi)藥物的主要代表為ETV，但由于其具有高耐藥基因屏障的特點(diǎn)[7]，往往需有L180M、M204I/V、I169T、T184G、S202I、M250V等多個(gè)突變位點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮作用，才導(dǎo)致HBV對(duì)ETV的最終耐藥，故這方面的分子模型研究相對(duì)于前2類(lèi)藥物來(lái)說(shuō)，顯得更為困難。目前為數(shù)不多的有關(guān)HBV耐ETV分子模型研究表明，169位點(diǎn)和250位點(diǎn)的突變可能主要通過(guò)影響反轉(zhuǎn)錄酶的引物結(jié)合區(qū)，促進(jìn)引物與模板更緊密結(jié)合而發(fā)揮作用；184位點(diǎn)和202位點(diǎn)的突變則可能通過(guò)影響模板結(jié)合區(qū)域的α螺旋和C區(qū)催化天冬氨酸殘基的β片層之間的疏水區(qū)，進(jìn)而增強(qiáng)M204I/V突變而發(fā)揮作用[25]。

3 HBV基因型與耐藥模式

目前已發(fā)現(xiàn)，HBV有A～J共10個(gè)基因型，我國(guó)以基因型B、C為主，歐美則以基因型A、D為主[26,27]。對(duì)基因型差異對(duì)HBV耐藥的影響，近年來(lái)開(kāi)展了一系列的研究，將為今后針對(duì)不同人群采取個(gè)性化的耐藥防治措施提供重要依據(jù)。

Wiegand等于2008年研究指出，HBV基因型與干擾素治療療效相關(guān)，但HBV基因型與核苷(酸)類(lèi)藥物的抗病毒療效是否相關(guān)，尚證據(jù)不足[28]。

Locarnini等于2010年的研究成果表明，基因型分布不同可通過(guò)影響耐藥通路而影響核苷(酸)類(lèi)藥物的抗病毒療效[29]。該研究結(jié)果顯示，基因型A主要通過(guò)M204V通路發(fā)生HBV耐LAM，而基因型B、C、D則主要通過(guò)M204I通路發(fā)生HBV耐LAM；基因型C主要通過(guò)A181T通路發(fā)生HBV耐ADV，而基因型D則通過(guò)A181V通路發(fā)生HBV耐ADV。這一研究說(shuō)明，不同基因型HBV發(fā)生各種耐藥性突變的頻率并不一致?；蛐头植际欠褚才cHBV對(duì)ETV及LdT等不同耐藥突變的發(fā)生頻率相關(guān)，尚缺乏相關(guān)研究資料。

有研究表明，rtM204I/V與rtL180M之間有密切關(guān)聯(lián)[9-11]，Locarnini等[29]對(duì)2003～2009年報(bào)道的具有不同HBV基因型的262例患者進(jìn)行rtM204I/V與rtL180M關(guān)聯(lián)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因型A、B、D患者中rtL180M與rtM204I關(guān)聯(lián)的頻率較基因型C患者小，而rtL180M與rtM204V關(guān)聯(lián)的頻率則正好相反，提示HBV基因型對(duì)rtM204I/V與rtL180M的關(guān)聯(lián)性有影響。

4 HBV耐藥預(yù)防新觀(guān)念

HBV雖為DNA病毒，其復(fù)制卻與RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄復(fù)制極其相似。由于該復(fù)制極不穩(wěn)定，所以容易導(dǎo)致耐藥突變的產(chǎn)生，包括自然產(chǎn)生和藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生[18]。HBV耐藥的發(fā)生實(shí)際上是宿主、HBV、藥物三者之間相互作用的結(jié)果。按照基因屏障學(xué)說(shuō)，僅單位點(diǎn)突變導(dǎo)致的耐藥往往比多位點(diǎn)突變導(dǎo)致的耐藥更易發(fā)生，即HBV對(duì)高基因屏障藥物往往不易發(fā)生耐藥。按照藥代動(dòng)力學(xué)屏障學(xué)說(shuō)[30]，若某種藥物對(duì)野毒株和耐藥株的復(fù)制均具很強(qiáng)的抑制作用，病毒復(fù)制就可維持于較低水平，產(chǎn)生耐藥的可能性很小，即早期抑制病毒復(fù)制能力越強(qiáng)的藥物，后續(xù)治療時(shí)對(duì)其發(fā)生耐藥的可能性越小。抑制病毒作用越強(qiáng)、越快，對(duì)其產(chǎn)生耐藥的可能性越小。

以往人們對(duì)HBV耐藥的認(rèn)識(shí)主要停留于“無(wú)復(fù)制等于無(wú)耐藥”，過(guò)于強(qiáng)調(diào)抑制病毒復(fù)制的層面。但最近研究發(fā)現(xiàn)，由于HBV基因組結(jié)構(gòu)中S區(qū)完全位于P區(qū)內(nèi)，DNA聚合酶的相關(guān)耐藥突變常同時(shí)導(dǎo)致HBV表面抗原、抗體結(jié)合域發(fā)生重要結(jié)構(gòu)改變，其中包括抗病毒藥物相關(guān)的潛在疫苗逃避突變(antiviral drug-associated potential vaccine escape mutant，ADAPVEM)。這一突變的產(chǎn)生導(dǎo)致疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗體無(wú)法執(zhí)行中和病毒的功能，從而可能對(duì)目前開(kāi)展全球乙型肝炎免疫接種計(jì)劃帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。因此，HBV耐藥的預(yù)防不僅要求采取有效抑制病毒復(fù)制的措施，還應(yīng)做到防止ADAPVEM的出現(xiàn)[31,32]。

5 結(jié)語(yǔ)

目前，關(guān)于CHB治療中HBV對(duì)核苷(酸)類(lèi)似物的耐藥機(jī)制，臨床與基礎(chǔ)研究在分子和基因水平上解釋了許多相關(guān)現(xiàn)象，但許多認(rèn)識(shí)仍很初步，機(jī)體免疫機(jī)制在HBV耐藥中的作用尚不明確，包括未發(fā)現(xiàn)耐藥相關(guān)基因突變但臨床治療療效應(yīng)答不佳的原因。隨著研究不斷深入，人們將更全面認(rèn)識(shí)HBV耐藥的發(fā)生過(guò)程，從而針對(duì)性地進(jìn)行耐藥預(yù)防和干預(yù)，提高療效，改善患者的預(yù)后。

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