DC-CIK聯(lián)合化療治療結(jié)腸癌的臨床研究

李 莎 李 巖 梁 婧 劉曉琳 (山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院，濟(jì)南250014)

目前，全球結(jié)腸癌的發(fā)病率及死亡率處于上升趨勢(shì)，手術(shù)及術(shù)后輔助化療可減緩結(jié)腸癌疾病進(jìn)展。手術(shù)及多周期化療后，患者機(jī)體免疫功能受到不同程度的損傷，自體細(xì)胞免疫治療成為結(jié)腸癌的重要治療手段［1］。

樹(shù)突狀細(xì)胞是功能強(qiáng)大的專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞(Antigen presenting cell，APC)，可高效介導(dǎo)對(duì)特異性抗原的免疫應(yīng)答。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和非主要組織相容性復(fù)合體(MHC)限制性殺瘤的優(yōu)點(diǎn)。DC-CIK細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣的優(yōu)點(diǎn)。本研究通過(guò)DC-CIK聯(lián)合化療治療結(jié)腸癌，旨在探討DC-CIK免疫治療在實(shí)體瘤治療中的有效性和安全性。

1 資料與方法

1.1一般資料 病例入選標(biāo)準(zhǔn)：①按國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)1997年分期標(biāo)準(zhǔn)結(jié)腸癌TNM分期為Ⅱ、Ⅲ期術(shù)后患者;②所有病例術(shù)后病理檢查證實(shí)均為腺癌;③卡氏評(píng)分KPS≥70分;④無(wú)嚴(yán)重心肺、肝、腎等內(nèi)科疾病;⑤治療前常規(guī)行腹部CT、全身骨ECT、心電圖、血常規(guī)及肝腎功能檢查正常。

收集2008年1月至2009年12月就診于山東省千佛山醫(yī)院腫瘤科的40例Ⅱ～Ⅲ期結(jié)腸癌患者符合入選標(biāo)準(zhǔn)，其中男28例，女12例，年齡35～77歲。隨機(jī)選取20例作為單純化療組，僅行化療，20例作為聯(lián)合治療組，給予DC-CIK聯(lián)合化療。兩組一般情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。本臨床試驗(yàn)的程序均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，全部受試患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2主要儀器與試劑 流式細(xì)胞儀FACS Calibur(美國(guó)BD公司);COBE Spectra血液成份分離機(jī)(美國(guó) Gambro BCT公司);酶聯(lián)免疫酶標(biāo)儀(丹麥DenkeyDragon);Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(美國(guó)Sigma公司);T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒(古巴分子免疫學(xué)中心);抗人 IFN-γ、IL-2、IL-6 ELISA 試劑盒(上海森雄科技有限公司)。

1.3DC-CIK細(xì)胞培養(yǎng) DC的體外誘導(dǎo)成熟：用血細(xì)胞分離機(jī)采集患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106ml-1，置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2 小時(shí)，將懸浮細(xì)胞移出，向培養(yǎng)瓶中加入 GM-CSF、IL-4，每2天換液 1次，并補(bǔ)充相關(guān)細(xì)胞因子，第6天加入 IFN-γ，誘導(dǎo) DC成熟。

CIK細(xì)胞的體外誘導(dǎo)和擴(kuò)增：以同樣方法采集供者PBMC，用AIMV無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106ml-1，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時(shí)。收集懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)并用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為1×106ml-1，第1天加入IFN-γ，24小時(shí)后加入CD3McAb及IL-2，每2天換液1次。

表1 兩組臨床資料情況比較Tab．1 The clinical data of two groups

DC和CIK共培養(yǎng)：第8天將收獲成熟的DC與CIK細(xì)胞按照1∶10比例混合共培養(yǎng)6天。細(xì)胞培養(yǎng)第0天及每次收集細(xì)胞回輸前取1 ml樣品進(jìn)行免疫表型檢測(cè)。

1.4治療方案 單純化療組：化療方案：奧沙利鉑130 mg/m2，靜滴2小時(shí)滴完，第1天;CF 200 mg/m2，第2～6天;5-Fu 500 mg/m2，靜滴4～6小時(shí)，第2～6天，21天為1周期，根據(jù)患者情況術(shù)后輔助化療4～6個(gè)周期。

聯(lián)合治療組：患者行化療前2天血細(xì)胞分離機(jī)單采外周血單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng) DC-CIK細(xì)胞。第3天起開(kāi)始行化療。細(xì)胞培養(yǎng)第13天時(shí)，經(jīng)細(xì)菌、真菌及內(nèi)毒素檢測(cè)陰性后收集細(xì)胞，將收集的細(xì)胞用無(wú)菌生理鹽水洗滌3次后混懸于含2%白蛋白的200 ml生理鹽水中，于第14～16天連續(xù)回輸3天，1次/天，每次1.5小時(shí)內(nèi)回輸完畢，共接受2個(gè)療程DC-CIK細(xì)胞治療。

1.5T細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子水平測(cè)定 抽取兩組患者治療前后外周血，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞亞群中 CD3+、CD4+、CD8+、CD16+CD56+效應(yīng)細(xì)胞的比例及CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例。ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-6的表達(dá)水平，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.6療效評(píng)定指標(biāo) 治療期間定期復(fù)查血常規(guī)、肝腎功能、腫瘤標(biāo)志物及結(jié)腸鏡、腹部B超、螺旋CT，必要時(shí)行PET-CT檢查以了解腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等情況。隨訪(fǎng)兩組患者的局部復(fù)發(fā)率、生存率。通過(guò)測(cè)定T細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子水平，評(píng)估機(jī)體免疫功能的改善情況。比較兩組患者周?chē)窠?jīng)毒性、骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)發(fā)生率，毒性反應(yīng)按 WHO(1998)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)分為0～Ⅳ度。觀察每次輸注DC-CIK細(xì)胞過(guò)程中及回輸后患者有無(wú)發(fā)熱、過(guò)敏等不良反應(yīng)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包，進(jìn)行t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1比較治療后局部復(fù)發(fā)率、生存率 單純化療組隨訪(fǎng)20例，聯(lián)合治療組隨訪(fǎng)20例，化療組局部復(fù)發(fā)率高于聯(lián)合組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，而1、2年生存率低于聯(lián)合治療組，比較無(wú)明顯差異(P＞0.05見(jiàn)表2。

2.2治療前后對(duì)患者外周血T細(xì)胞亞群的影響兩組患者治療前后外周血T細(xì)胞亞群的變化如表3所示，其中化療組治療后外周血 CD3+、CD4+、CD16+CD56+效應(yīng)細(xì)胞和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞有變化但無(wú)顯著差異(P＞0.05)，CD8+效應(yīng)細(xì)胞比例升高，CD4+/CD8+比值下降(P＜0.05);而聯(lián)合組治療后外周血CD4+(見(jiàn)圖1)，CD16+CD56+效應(yīng)細(xì)胞的比例(見(jiàn)圖2)和CD4+/CD8+比值顯著升高(P＜0.05)，CD8+效應(yīng)細(xì)胞比例下降但無(wú)顯著差異(P＞0.05)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例顯著下降(見(jiàn)圖3，P＜0.05)。

2.3治療前后對(duì)患者細(xì)胞因子的影響 如實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表4)示，化療組治療后IL-6升高(P＜0.05)，IFN-γ、IL-2降低，但無(wú)顯著差異。聯(lián)合組治療后IFN-γ較治療前顯著升高(P＜0.05)，IL-2和 IL-6變化無(wú)明顯差異。

2.4DC-CIK聯(lián)合化療的安全性評(píng)價(jià) 兩組患者治療后相關(guān)毒性反應(yīng)主要為周?chē)窠?jīng)毒性、骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)。Ⅰ～Ⅱ度周?chē)窠?jīng)毒性，主要表現(xiàn)為感覺(jué)遲鈍和(或)感覺(jué)異常(可逆轉(zhuǎn));Ⅰ～Ⅱ度胃腸道反應(yīng)主要表現(xiàn)為惡心、嘔吐(可控制)。聯(lián)合組發(fā)生率低于化療組(P＜0.05)。骨髓抑制以Ⅰ～Ⅱ度白細(xì)胞減少為主，應(yīng)用重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)后可繼續(xù)完成治療?；熃M和聯(lián)合組發(fā)生率無(wú)顯著差異(P＞0.05，見(jiàn)圖4)。在 DC-CIK細(xì)胞回輸過(guò)程中及回輸后，僅1例患者出現(xiàn)發(fā)熱，體溫38.2℃，持續(xù)時(shí)間約3～5小時(shí)，經(jīng)對(duì)癥處理后緩解;未觀察到胸悶、低血壓、過(guò)敏、休克等不良反應(yīng)，未出現(xiàn)明顯肝腎功能、凝血功能受損。

圖1 DC-CIK聯(lián)合治療前后外周血CD4+T細(xì)胞比例Fig．1 The ratios of CD4+cells in combined therapy group before and after therapy

圖2 DC-CIK聯(lián)合治療前后外周血NK細(xì)胞比例Fig．2 The ratios of CD16+CD56+cells in combined therapy group before and after therapy

表2 兩組患者治療結(jié)束后隨訪(fǎng)復(fù)發(fā)、生存情況(%)Tab．2 The rate of recurrence and survival of two groups(%)

表3 兩組患者治療前后T細(xì)胞亞群變化(x ± s，%)Tab．3 Changes of T cell subsets of two groups(x ± s，%)

圖3 DC-CIK聯(lián)合治療前后外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例Fig．3 The ratios of CD4+CD25+cells in combined therapy group before and after therapy

表4 兩組患者治療前后細(xì)胞因子變化(x ± s，ng/L)Tab．4 Changes of intra-cellular cytokines of two groups(x ± s，ng/L)

3 討論

結(jié)腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，術(shù)后輔助化療對(duì)控制局部復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有顯著作用，但化療藥物只能殺滅一定比例的腫瘤細(xì)胞，很難清除微小殘留病變，最終需聯(lián)合免疫治療進(jìn)一步提高療效。

結(jié)腸癌患者的免疫功能常呈現(xiàn)抑制狀態(tài)，免疫功能越低，越會(huì)發(fā)生“免疫漂移”(Immune shift)改變［2］，即Th1/Th2平衡失調(diào)并向 Th2轉(zhuǎn)化，嚴(yán)重影響機(jī)體的抗腫瘤能力。成熟T細(xì)胞屬異質(zhì)性群體，兩個(gè)主要亞群，即輔助性T細(xì)胞(Th)CD4+和抑制性細(xì)胞(Ts)CD8+，CD4+Th細(xì)胞根據(jù)其分泌細(xì)胞因子的不同，分為T(mén)h0、Th1、Th2三個(gè)亞型。Th0細(xì)胞是未成熟的前體細(xì)胞，向 Th1、Th2細(xì)胞分化。Th1細(xì)胞主要分泌 IL-2、干擾素-γ(Interferon-gamma，IFN-γ)和腫瘤壞死因子α、β(Tumor necrosis factor-α、β，TNF-α、β)，而 Th2 細(xì)胞主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10。近年來(lái)又報(bào)道了 Th3 亞型［3］，可大量分泌TNF-β、IL-4和IL-10，下調(diào)APC及Th1細(xì)胞活性，誘導(dǎo)免疫耐受。

CD3存在于所有T細(xì)胞表面，可反映CD4+和CD8+T細(xì)胞的總體水平。CD4+Th細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒有關(guān)的免疫應(yīng)答，促進(jìn)B細(xì)胞增殖、分化及產(chǎn)生抗體。一般認(rèn)為，腫瘤患者外周血的CD8+細(xì)胞主要是抑制性T細(xì)胞。CD4+/CD8+比值可作為判斷機(jī)體免疫功能狀態(tài)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。結(jié)腸癌患者CD4+/CD8+比值變小，表明機(jī)體免疫功能低下，可能與腫瘤細(xì)胞分泌免疫抑制因子，誘導(dǎo)CD8+的產(chǎn)生，同時(shí)阻止 CD4+的形成和成熟［4］，降低機(jī)體抗腫瘤免疫有關(guān)。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞作為免疫抑制細(xì)胞，參與腫瘤的免疫逃逸，抑制 CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖和活化［5］。腫瘤患者外周血、腫瘤浸潤(rùn)淋巴結(jié)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例升高。NK細(xì)胞的特征性表型主要是CD16+CD56+，是機(jī)體免疫監(jiān)視系統(tǒng)的重要組成成份，NK細(xì)胞數(shù)量減少減弱了機(jī)體的免疫機(jī)能。

圖4 兩組患者毒性反應(yīng)發(fā)生率(%)Fig．4 Incidence of side effects of two groups(%)

研究表明，化療藥物誘導(dǎo)的調(diào)亡腫瘤細(xì)胞能有效誘發(fā)免疫應(yīng)答，對(duì)隨后的免疫治療起到增益作用［6］。Marten等［7］發(fā)現(xiàn)將同源 DC 和 CIK 細(xì)胞共培養(yǎng)后，DC和CIK細(xì)胞的增殖能力及CIK細(xì)胞的殺傷活性均明顯增強(qiáng)。樹(shù)突狀細(xì)胞刺激初始T細(xì)胞(naive T cells)活化增殖，誘導(dǎo)抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞成熟［8］。絕大多數(shù)腫瘤患者存在DC數(shù)量減少和功能障礙，提示體外誘導(dǎo)足夠數(shù)量的功能強(qiáng)大的DC用于糾正患者的免疫缺陷成為一種可能。CIK可特異地聚集于腫瘤局部發(fā)揮靶向抗腫瘤作用;分泌大量的 Th1 類(lèi)細(xì)胞因子［9］，如 IFN-γ、IL-2及IL-12，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)CIK殺傷作用的敏感性;還能分泌IL-6、TNF-α及GM-CSF等細(xì)胞因子，增強(qiáng)細(xì)胞毒作用。大量研究表明，DC與CIK細(xì)胞共同培養(yǎng)后，DC的抗原提呈及激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答的能力提高，CIK的增殖活性和細(xì)胞毒作用增強(qiáng)［10］。

本文基于對(duì)單純化療與DC-CIK聯(lián)合化療治療Ⅱ、Ⅲ期結(jié)腸癌同期對(duì)照研究，治療前兩組患者臨床資料無(wú)顯著差異，治療后化療組局部復(fù)發(fā)率高于聯(lián)合組，而1、2年生存率低于聯(lián)合組，無(wú)明顯差異，可能是因?yàn)椴±龜?shù)較少，隨訪(fǎng)時(shí)間較短，有待今后擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步隨訪(fǎng)獲得相應(yīng)臨床數(shù)據(jù)。應(yīng)敏剛等［11］對(duì)Ⅰ～Ⅲ期結(jié)腸癌術(shù)后患者進(jìn)行了相關(guān)研究，DC-CIK聯(lián)合組和對(duì)照組中位生存期分別為63個(gè)月(95%CI，55～72)、52個(gè)月(95%CI，42～62)，Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)和Logrank test檢驗(yàn)結(jié)果表明，聯(lián)合組生存期明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(P＜0.05)。因此，聯(lián)合DC-CIK可降低局部復(fù)發(fā)率，有可能提高患者的生存率，延長(zhǎng)生存期。

從兩組患者治療前后T細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果看，聯(lián)合組治療后外周血CD4+/CD8+比值升高，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例下降，說(shuō)明聯(lián)合治療可使結(jié)腸癌患者免疫功能得以恢復(fù)與提高，進(jìn)一步殺傷化療后那些殘存的腫瘤細(xì)胞。Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ可抑制Th2細(xì)胞增殖，Th2細(xì)胞分泌的IL-6可下調(diào)Th1細(xì)胞的活性，導(dǎo)致免疫障礙。新近研究顯示，DC-CIK 聯(lián)合治療可增加 IFN-γ 的表達(dá)［12］。本研究與此研究結(jié)果一致。DC與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)后，DC與CIK細(xì)胞均被進(jìn)一步激活，IL-2、IFN-γ分泌顯著升高，增加抗腫瘤效應(yīng)。

此外，聯(lián)合組患者Ⅰ～Ⅱ度周?chē)窠?jīng)毒性、胃腸道反應(yīng)發(fā)生率較化療組明顯降低，并在免疫細(xì)胞回輸過(guò)程中僅1例患者出現(xiàn)發(fā)熱，未發(fā)現(xiàn)其他不良反應(yīng)。因此，DC-CIK聯(lián)合化療治療結(jié)腸癌是安全有效的，不僅活化了體內(nèi)T細(xì)胞，增強(qiáng)了腫瘤殺傷力，同時(shí)下調(diào)了CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫抑制性，破壞了腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的內(nèi)環(huán)境，提高機(jī)體整體免疫功能，有良好的應(yīng)用價(jià)值和治療前景。

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