佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠肺功能與Treg、Notch信號(hào)通路的關(guān)系①

劉 健 萬 磊 程園園 馮云霞 劉 磊 黃傳兵 汪 元

(安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，合肥230031)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性、持續(xù)性、對(duì)稱性關(guān)節(jié)炎為特征的全身自身免疫性疾病，其病理表現(xiàn)主要有滑膜炎、血管炎等，常常侵及到滑膜、軟骨和骨質(zhì)，導(dǎo)致出現(xiàn)滑膜增生、軟骨吸收和骨質(zhì)破壞，還可以累及到全身各個(gè)臟器。肺中的血管和結(jié)締組織豐富，所以肺部受累幾率更高。RA累及到肺組織的主要表現(xiàn)為肺間質(zhì)纖維化、胸膜病變、肺內(nèi)結(jié)節(jié)、Caplan綜合征等，其中最常見的為肺間質(zhì)纖維化。肺間質(zhì)纖維化病變不可逆，嚴(yán)重影響RA患者的生活質(zhì)量［1-3］。RA的發(fā)生發(fā)展與免疫細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)失衡密切相關(guān)，實(shí)驗(yàn)研究表明，佐劑關(guān)節(jié)炎(Adjuvant arthritis，AA)大鼠肺功能明顯降低，且肺功能參數(shù)與肺組織高分辨率CT、細(xì)胞因子呈高度相關(guān)［4，5］。最新研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路不僅調(diào)控免疫細(xì)胞譜系的產(chǎn)生，還可以通過參與調(diào)節(jié)外周成熟免疫細(xì)胞的進(jìn)一步分化而發(fā)揮作用［6，7］。而RA的發(fā)生也是免疫細(xì)胞不斷分化的過程，因此，可以推測(cè)Notch信號(hào)通路可能參與RA及RA引起肺病變的發(fā)病過程。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)(SPF)雄性SD大鼠20只，鼠齡6～7月，體質(zhì)量為(180～200)g，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，并給予充足的水份和食物，供試前在清潔動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng)7天，觀察無異常者入組實(shí)驗(yàn)。

1.2試劑與儀器

1.2.1主要試劑 弗氏完全佐劑(CFA)，美國(guó)Sigma公司出品(批號(hào)：098k8729);異硫氫酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗鼠CD4單抗，購(gòu)自美國(guó)e-Bioscience公司(批號(hào)：11-0040)、藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的抗鼠CD25單抗，購(gòu)自美國(guó)Bio-Legend公司(批號(hào)：202105);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(M-Mulv Reverse，批號(hào)：00076653)、PCR 擴(kuò)增試劑盒(PCR Master Mix，批號(hào)：00077926)，購(gòu)自加拿大Fermentas公司;Notch受體及配體引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2主要儀器 動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)，北京貝蘭博科技有限公司生產(chǎn)(AniRes2003)。高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司(Centrifuge 5417R);紫外可見分光光度計(jì)，日本 SHIMADZU 公司(UV2401PC);PCR擴(kuò)增儀，德國(guó)Biometra公司(TGradient Thermoblock);電泳儀，美國(guó)Amersham公司(EPS-301);凝膠圖像分析儀，美國(guó) Bio-Rad公司(Gel Doc XR);流式細(xì)胞儀，美國(guó)Beckman Coulter公司(Epics XL)。

1.3模型復(fù)制 將20只SD大鼠隨機(jī)分為2組：正常對(duì)照組(NC)，模型對(duì)照組(MC)，每組10只。向MC組每只動(dòng)物右后足跖皮內(nèi)注射CFA 0.1 ml，復(fù)制成AA模型［8］。致炎18天后用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉(0.35 ml/100 g，v/m)，將大鼠氣管切成“T”字狀，氣管插管，檢測(cè)兩組大鼠肺功能;靜脈采血，4小時(shí)內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg);打開胸腔取出肺臟，完整分離出氣管和雙肺，去除周圍結(jié)締組織，取右肺中葉置于福爾馬林(10%)固定，備用;取大鼠左肺組織［約(100±20)mg］裝入凍存管中，置液氮中備用。

1.4主要指標(biāo)

1.4.1足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)的測(cè)算 足跖腫脹度：分別在造模前1天、致炎后第18天測(cè)量各組大鼠后足跖的容積，計(jì)算各組大鼠足跖腫脹度［9］，腫脹度：E(%)=(Vt-Vn)/Vn×100%(Vn、Vt分別代表造模前后的容積)。關(guān)節(jié)炎指數(shù)：致炎后開始觀察并記錄全身關(guān)節(jié)病變情況，每3天1次。全身病變按5級(jí)評(píng)分法評(píng)價(jià)，根據(jù)未注射佐劑的其余3只肢體的病變程度累積積分，計(jì)算出AI［10］。0分：無紅腫;1分：小趾關(guān)節(jié)紅腫;2分：趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹;3分：踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹;4分：包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。累計(jì)計(jì)算各個(gè)關(guān)節(jié)的積分。

1.4.2肺功能測(cè)定 致炎18天后，用小動(dòng)物肺功能儀測(cè)定肺功能。測(cè)定指標(biāo)：1秒內(nèi)平均呼氣流量(FEV1/FVC%)、25%肺活量的最大呼氣流量(FEF25)、50%肺活量的最大呼氣流量(FEF50)、75%肺活量的最大呼氣流量(FEF75)、用力最大呼氣流量(PEF)、肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性(Cldyn)。操作過程：10%水合氯醛(0.35 ml/100 g，v/m)腹腔注射麻醉，氣管切開行氣管插管，將大鼠置于體描箱內(nèi)，與呼吸機(jī)相連，機(jī)械通氣測(cè)肺功能。

1.4.3肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察 將肺組織于10%福爾馬林固定8小時(shí)后，依次予脫水、透明、浸蠟和包埋，切片(6 μm)作HE染色。肺泡炎程度：無肺泡炎(-);輕度肺泡炎(+)：肺泡隔因細(xì)胞浸潤(rùn)增寬，病變范圍局限在全肺的20%以下;中度肺泡炎(++)：病變范圍占全肺的20% ～50%;重度肺泡炎(+++)：呈彌漫性分布，病變范圍大于50%;分別記為 0、1、2、3 分［11］。

1.4.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠外周血Treg 取大鼠新鮮血液置于肝素鈉采血管，按每106個(gè)細(xì)胞/管分別加入 CD4-FITC 0.25 μg、CD25-PE 1.0 μg，室溫避光20～30分鐘;加紅細(xì)胞裂解液1 ml，避光15～25分鐘;用PBA洗兩遍，離心棄上清，加500 μl PBA，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+Treg占CD4+比例。

1.4.5RT-PCR法檢測(cè)肺組織Notch配體及受體

引物的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù) Gene-Bank提供的Notch1mRNA 序列(NM_001105721)、Notch2mRNA序列(NM_024358)、Notch3mRNA序列(NM_020087)、Notch4mRNA 序列(NM_001002827)和Jagged1mRNA序列(NM_019147)、Jagged2mRNA序列(XM_001073124)、Delta1mRNA序列(NM_032063)。使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)并分析引物。引物序列見表1。PCR反應(yīng)：以GAPDH作為內(nèi)部參考，每組樣品具有相同的cDNA樣本和相同的PCR擴(kuò)增條件，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，每一循環(huán)包括變性(94℃)30秒，退火(Jagged1：56℃、Jagged2：56℃、Delta1：58℃、Notch1：54℃、Notch2：55℃、Notch3：58℃、Notch4：57℃、DAPDH：60℃)40秒，延伸(72℃)60秒，最后72℃延伸10分鐘，4℃終止;擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠(含0.1 μg/ml溴化乙啶)中進(jìn)行電泳，電壓為90伏，時(shí)間為65分鐘;凝膠掃描儀掃描溴化乙啶染色后的凝膠。利用Bio-Rad凝膠圖像分析儀進(jìn)行照相，采用Image-Pro Plus軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，計(jì)算電泳條帶光密度(IOD)，以 Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Jagged1、Jagged2、Delta1與GAPDH 的IOD比值作為表達(dá)的相對(duì)含量。

1.5統(tǒng)計(jì)分學(xué)析 采用SPSS11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為連續(xù)性變量用±s表示，樣本均采用正態(tài)性檢驗(yàn);NC組與MC組的足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、肺泡炎積分、肺功能及Treg、Notch mRNA光密度值等比較，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用多元相關(guān)及多元逐步回歸分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。

2 結(jié)果

2.1AA大鼠足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)的變化 致炎前兩組大鼠足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)無差異;模型復(fù)制后，致炎6小時(shí)，MC組大鼠右后足趾開始出現(xiàn)紅腫，致炎第3天，MC組大鼠足跖腫脹度達(dá)最高峰，后逐漸下降，第4、5天部分雙前足趾開始出現(xiàn)紅腫，致炎12天關(guān)節(jié)炎指數(shù)達(dá)高峰，后逐漸下降。見圖 1、2。

2.2AA大鼠肺功能參數(shù)的比較 模型復(fù)制第18天，與NC組相比，MC組肺功能參數(shù) FEF75、PEF、Cldyn明顯降低;FEV1/FVC%明顯升高(P＜0.01)，F(xiàn)EF25、FEF50兩組比較無顯著意義(P＞0.05)。見表2。

2.3AA大鼠肺組織的形態(tài)學(xué)改變 光鏡觀察：NC組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，未出現(xiàn)明顯形態(tài)學(xué)改變;MC組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡變大、變形，部分呈肺實(shí)變，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以中性粒細(xì)胞為主，并且有少量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn);肺泡壁局部增厚，肺間隔明顯增寬，部分肺泡腔內(nèi)有不同程度的出血、水腫;偶見成纖維細(xì)胞增殖，膠原纖維結(jié)締組織沉積，見圖3、4。依據(jù)Szapiel確定的肺泡炎積分較NC組明顯增加，(P＜0.01)，見表 2。

表1 Notch受體、配體引物序列及預(yù)擴(kuò)增長(zhǎng)度Tab．1 Primer sequences and pre-expansion growth of Notch receptor and ligand

2.4AA大鼠外周血Treg及肺組織Notch受體、配體mRNA的表達(dá) 與NC組比較，MC組Notch3、Notch4、Delta1的表達(dá)水平明顯升高(P＜0．05或P＜0.01)，Notch2的表達(dá)升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);Notch1、Jagged1、Jagged2 及 CD4+CD25+Treg的表達(dá)明顯降低(P＜0.01)。見表3，圖4。

圖1 各組大鼠足趾腫脹度的比較Fig．1 Comparison of paw swelling degree in rats

圖2 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的比較Fig．2 Comparison of arthritis index in rats

表2 2組肺泡炎積分、肺功能比較(n=10，±s)Tab．2 Comparison of alveolitis points，lung function in two groups(n=10，±s)

表2 2組肺泡炎積分、肺功能比較(n=10，±s)Tab．2 Comparison of alveolitis points，lung function in two groups(n=10，±s)

Note：Compared with the NC group，1)P＜0.01，2)P＜0.05.

Index NC group MC group Alveolitis points(points) 0.42±0.61 2.21±0.971)Lung function parameter FEV1/FVC(%) 57.70±5.79 68.60±6.381)FEF25(ml/s) 42.30±10.10 38.90±12.80 FEF50(ml/s) 39.80±9.88 34.70±7.29 FEF75(ml/s) 36.40±8.57 26.40±9.611)PEF(ml/s) 40.10±6.89 31.10±5.571)Cldyn 0.37±0.21 0.24±0.162)

表3 各組大鼠Notch受體、配體及CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比較(n=10，±s)Tab．3 Comparison of Notch receptors，ligands，and CD4+CD25+regulatory T cells of lung tissue in rats(n=10，±s)

表3 各組大鼠Notch受體、配體及CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比較(n=10，±s)Tab．3 Comparison of Notch receptors，ligands，and CD4+CD25+regulatory T cells of lung tissue in rats(n=10，±s)

Note：Compared with the NC group，1)P＜0.01，2)P＜0.05.

NC groups MC groups Jagged1mRNA 0.58±0.22 0.33±0.141)Jagged2mRNA 0.56±0.34 0.40±0.211)Delta1mRNA 0.49±0.18 0.65±0.341)Notch1mRNA 0.67±0.25 0.42±0.191)Notch2mRNA 0.52±0.31 0.54±0.22 Notch3mRNA 0.43±0.16 0.62±0.391)Notch4mRNA 0.41±0.18 0.54±0.252)CD4+CD25+Treg 8.65±2.86 5.12±3.151)

圖3 各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色，×200)Fig．3 Morphology of lung tissue in rats(stained with HE，×200)

圖4 各組大鼠Notch受體、配體表達(dá)Fig．4 Expression of Notch receptor and ligands mRNA of lung tissue in rats

表4 AA大鼠肺功能參數(shù)與CD4+CD25+Treg、Notch受體、配體指標(biāo)的相關(guān)性分析(r)Tab．4 Correlation between lung function parameter and CD4+CD25+Treg，Notch receptor，ligand in AA rats(r)

2.5相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，AA大鼠肺功能參數(shù)FVC、FEF75與CD4+CD25+Treg呈正相關(guān)，F(xiàn)EF50、MMF與 Jagged1、Notch1呈正相關(guān);FEF25、FEF50、PEF 與 Delta1、Notch3、Notch4 呈負(fù)相關(guān)(P＜0.01或P＜0.05)，見表4。

3 討論

RA常表現(xiàn)為外周關(guān)節(jié)的滑膜炎，還可以侵及全身其他的組織和臟器，肺組織因?yàn)楹胸S富的結(jié)締組織和血液供應(yīng)，肺部最常受累。肺間質(zhì)病變是RA累及肺部最常見的病變，與其他風(fēng)濕病比較，RA侵及肺部的特點(diǎn)多位于肺基底部。Taichman等［12］研究表明，Notch信號(hào)在肺損害中起重要作用，Notch信號(hào)通路可以通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，對(duì)肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化、遷移、成熟等有著調(diào)控作用。同時(shí)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞也可能參與其發(fā)病過程，研究發(fā)現(xiàn)，RA患者外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)明顯降低，同時(shí)與RA的肺功能呈正相關(guān);調(diào)節(jié)性T細(xì)胞調(diào)控作用的降低導(dǎo)致關(guān)節(jié)局部或肺組織免疫復(fù)合物的形成和沉積［13］，從而激活信號(hào)傳導(dǎo)通道。免疫復(fù)合物的形成和沉積過程是RA發(fā)病的基礎(chǔ)，活化的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控一系列炎性反應(yīng)相關(guān)因子的表達(dá)，形成瀑布級(jí)聯(lián)放大的效應(yīng)，共同參與肺損傷過程［14，15］。

本組實(shí)驗(yàn)研究顯示，AA大鼠足趾腫脹度、AI升高的同時(shí)，其肺功能參數(shù)指標(biāo)如 FEF75、PEF、Cldyn降低，而反映肺組織炎癥的肺泡炎積分呈升高趨勢(shì)，這說明大鼠在CFA致炎后，引起關(guān)節(jié)局部炎癥浸潤(rùn)的同時(shí)，肺組織也同樣受累，肺功能呈降低趨勢(shì)，肺功能損害表現(xiàn)在通氣功能障礙，以限制性通氣功能障礙為主，肺的順應(yīng)性降低，這與我們先前研究相符［16］。同時(shí)我們研究發(fā)現(xiàn)AA大鼠肺Cldyn降低，提示RA在未發(fā)生間質(zhì)纖維化等嚴(yán)重結(jié)局時(shí)，即已出現(xiàn)肺組織的動(dòng)態(tài)順應(yīng)性、肺容積降低，阻礙氣體進(jìn)一步交換，損傷肺功能。通過對(duì)AA大鼠外周血中的Treg檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+Treg表達(dá)較正常組明顯降低，這與我們臨床的研究結(jié)果一致［17］。而進(jìn)一步檢測(cè)肺組織的Notch受體和配體，我們發(fā)現(xiàn)，AA大鼠肺組織中的Notch3、Notch4及Delta1的表達(dá)水平明顯升高，而Notch1、Jagged1、Jagged2的表達(dá)水平顯著降低，說明Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路可能參與了肺功能降低的過程;同時(shí)相關(guān)分析可知，AA大鼠外周血中CD4+CD25+Treg與Jagged1、Notch1呈正相關(guān)，與Delta1、Notch4呈負(fù)相關(guān)，AA大鼠肺功能降低可能與Treg調(diào)節(jié)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)，二者共同參與肺功能損傷的過程?？赡苁茿A大鼠在致炎后，沉積于關(guān)節(jié)和肺等組織局部的免疫復(fù)合物沒有及時(shí)清除，導(dǎo)致 Notch信號(hào)通路的激活，Notch受體與配體結(jié)合作用于鄰近細(xì)胞，進(jìn)一步參與T細(xì)胞的增殖、活化，從而導(dǎo)致肺功能的降低。

Notch是一個(gè)跨膜受體蛋白家族，它是通過Notch配體與受體的相互作用而轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化，對(duì)生物體的細(xì)胞增殖、分化和凋亡起著重要的作用。Notch受體有四種，分別為Notch1、Notch2、Notch3、Notch4 等，配體有五種，包括Delta1、Delta3、Delta4、Jagged1 和 Jagged2 等，相鄰細(xì)胞可以通過Notch配體與受體的結(jié)合傳遞Notch信號(hào)，從而擴(kuò)大、固化細(xì)胞間的分子差異，最終決定生物體細(xì)胞的歸屬［18］。配體在T細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞(APC)表面均有表達(dá)，通過與受體結(jié)合而觸發(fā)信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而調(diào)控各細(xì)胞譜系的發(fā)育和成熟［19］。在免疫系統(tǒng)中，Notch信號(hào)途徑不僅調(diào)控T、B細(xì)胞譜系的產(chǎn)生，還參與調(diào)節(jié)外周成熟T細(xì)胞及其亞群的分化和功能發(fā)揮［20］。T細(xì)胞在胸腺內(nèi)發(fā)育過程中通過凋亡進(jìn)行克隆清除，絕大多數(shù)胸腺細(xì)胞通過凋亡而消失，僅少部分發(fā)育成熟，這對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答系統(tǒng)的建立十分重要［21］。研究發(fā)現(xiàn)配體Delta1與受體Notch的相互作用是決定T淋巴細(xì)胞定向分化的關(guān)鍵［22］。當(dāng)Notch1活性受抑時(shí)，干細(xì)胞進(jìn)入分化程序，發(fā)育成終末功能細(xì)胞。而Notch3的表達(dá)增高可抑制此過程，使前體細(xì)胞維持在未分化狀態(tài)［23］，這就決定了細(xì)胞的分化程度。本組研究顯示AA大鼠肺組織中 Jagged1、Jagged2表達(dá)下調(diào)，而CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞出現(xiàn)下降，提示Notch配體中的Jagged1能抑制細(xì)胞的成熟，并通過抑制T淋巴細(xì)胞分化，不能誘導(dǎo)免疫耐受，同時(shí)Delta1表達(dá)下調(diào)說明Delta1和Jagged均可以競(jìng)爭(zhēng)性的抑制T細(xì)胞分化。Notch3和Notch4表達(dá)升高、Notch1表達(dá)降低提示在免疫復(fù)合物的刺激下，Notch3、Notch4與其配體Delta1結(jié)合可能誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，從而出現(xiàn)CD4+CD25+T細(xì)胞表達(dá)降低，導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能紊亂而出現(xiàn)AA大鼠肺功能降低。

綜上所述，RA致肺功能降低發(fā)病具體過程環(huán)節(jié)極為復(fù)雜，Notch通路中受體與其他配體，如Delta3、Delta4是如何對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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