LPS誘發(fā)sAPP-α轉(zhuǎn)基因鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷機(jī)制的初步探討

王 政 韓玉霞 蘇 剛 陳迪祥 肖元宏 (中國人民解放軍總醫(yī)院小兒外科，北京100853)

小兒孤獨(dú)癥(Autism)，又稱小兒自閉癥，是一類以嚴(yán)重孤獨(dú)、缺乏情感反應(yīng)、語言發(fā)育障礙、刻板重復(fù)動作和對環(huán)境奇特反應(yīng)為特征的疾病，在美國的發(fā)病率為萬分之14.9。根據(jù)全世界的統(tǒng)計，小兒孤獨(dú)癥的發(fā)病率大約為萬分之五，以中國目前現(xiàn)有的總?cè)丝跀?shù)量來估計，有五十萬左右的孤獨(dú)癥患者［1］。目前，對小兒孤獨(dú)癥并無特效治療，因此對于發(fā)病機(jī)制的研究，將為該病的有效治療提供理論依據(jù)。

小兒孤獨(dú)癥的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜：大量資料提示本病與遺傳有關(guān);也有研究發(fā)現(xiàn)與大腦器質(zhì)性損害有關(guān);還有研究者認(rèn)為疫苗免疫所引發(fā)的免疫損傷是造小兒孤獨(dú)癥發(fā)病的元兇。Sokol和他的同事研究發(fā)現(xiàn)，孤獨(dú)癥患兒體內(nèi)sAPP-α含量是正常兒童的兩倍，推測淀粉樣前蛋白(Amyloid precursor protein，APP)在孤獨(dú)癥患兒體內(nèi)更多以α切割形成sAPP-α為主，而非傳統(tǒng)上 β、γ切割形成Aβ肽段(Amyloid beta)［2］。

sAPP-α轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)過表達(dá) sAPP-α，模擬一種基因突變可能導(dǎo)致的小兒孤獨(dú)癥。對該小鼠的行為學(xué)、癥狀學(xué)分析表明，該小鼠模型在正常狀態(tài)下并不會自動發(fā)展為孤獨(dú)癥。本研究使用格蘭陰性細(xì)菌的主要毒力因子LPS感染小鼠，驗(yàn)證感染是否是促進(jìn)該類型小鼠發(fā)展成為孤獨(dú)癥的始動因素。低劑量LPS注射sAPP-α轉(zhuǎn)基因小鼠、嚴(yán)格對照小鼠，對小鼠體內(nèi)相關(guān)指標(biāo)，尤其是大腦內(nèi)病理改變進(jìn)行比較、分析。研究結(jié)果表明，代表著有可能發(fā)展成為小兒孤獨(dú)癥的sAPP-α轉(zhuǎn)基因小鼠，即使在低劑量LPS注射后，也出現(xiàn)了嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)損害，推測這種神經(jīng)系統(tǒng)的損害是促發(fā)孤獨(dú)癥發(fā)病的因素之一。

1 材料與方法

1.1動物和試劑 以C57BL/6為背景的轉(zhuǎn)基因小鼠sAPPα-Tg小鼠由本實(shí)驗(yàn)室從國外引進(jìn)，于我院基礎(chǔ)研究所動物房養(yǎng)殖，所有的動物實(shí)驗(yàn)均按照我院動物使用方法和規(guī)則進(jìn)行。出生后3周小鼠被選擇作為實(shí)驗(yàn)對象，該時期小鼠神經(jīng)系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)育完全。小鼠注射使用的LPS購買自Sigma公司，PBS重懸粉劑LPS，并調(diào)節(jié)到所需要的濃度，即用即配。50 μg LPS注射后，每天稱重小鼠直至20天。

1.2動物實(shí)驗(yàn)樣品的準(zhǔn)備 50 μg LPS注射小鼠后于不同時間點(diǎn)收獲，封閉容器內(nèi)乙醚對小鼠進(jìn)行麻醉后，心臟取血進(jìn)行外周血細(xì)胞計數(shù)檢測，分離血漿，-80°C儲存?zhèn)溆谩?0 ml預(yù)冷PBS灌注心臟后，分離小鼠大腦，右側(cè)大腦半球迅速于干冰中凍存保留，用于勻漿并提取上清，進(jìn)行炎癥因子檢測;左側(cè)大腦半球分離放置于4%的福爾馬林中過夜，后放置于梯度蔗糖液中脫水，蔗糖濃度依次為10%、20%、30%，且分別保存于4°C過夜。-20°C冰凍切片機(jī)將樣品切成25 μm或者40 μm附著于載玻片上的切片，一部分切片以懸浮形式保存于含有100 mmol/L疊氮化鈉的PBS 24孔板中，4°C保存。

1.3組織化學(xué) 大腦切片于1%Thioflavin S(ThioS，Sigma)在含有70%的乙醇溶液中孵育5分鐘，蒸餾水漂洗大腦切片2次，使用含有4＇，6＇-diamidino-2-phenylindole(DAPI，Vector Laboratories) 的熒光固定培養(yǎng)基進(jìn)行固定。Nissl染色用于檢測神經(jīng)細(xì)胞的外形結(jié)構(gòu)，主要檢測神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育畸形。簡單來說，漂浮大腦切片被固定在載玻片上，空氣中干燥后于1∶1酒精與氯仿中過夜孵育。然后，大腦切片使用梯度酒精溶液進(jìn)行脫水，0.1% 甲酚紫溶液染色5～10分鐘。蒸餾水漂洗后于95%酒精中干燥脫水，固定培養(yǎng)基進(jìn)行固定，按照文獻(xiàn)［3］方法進(jìn)行Cogo紅染色。

1.4免疫組織化學(xué) 大腦切片使用各種標(biāo)記神經(jīng)細(xì)胞的抗體進(jìn)行標(biāo)記，包括大鼠抗小鼠 CD11b(1∶1 000;Serotec)、FITC標(biāo)記的豚鼠抗倉鼠CD40(1∶100;BD Biosciences Pharmingen)、兔抗小鼠鈣離子結(jié)合適配器分子1(Ionized calcium binding adaptor molecule 1)(Iba1)(1∶1 000;Wako Pure Chemicals)、倉鼠抗小鼠 CD11c(1∶50;Pierce)、大鼠抗小鼠趨化因子受體(Chemokine receptor)Ccr2(1∶100;Novus Biologicals)、小鼠抗人 Aβ(clones 4G8 or 6E10;1∶500;Covance)、小鼠 anti-NeuN(1∶3 000;Millipore);然后將已經(jīng)經(jīng)過一抗染色的大腦切片使用相應(yīng)的Alexa Fluor 488和594結(jié)合的二抗室溫染色1小時，然后進(jìn)行 VECTASTAIN Elite ABC kit(Vector Laboratories)結(jié)合3，3＇-二二氨基聯(lián)苯胺染色顯色，顯微鏡下觀察。

1.5外周血細(xì)胞計數(shù)(Coulter counter) 50 μg LPS腹腔注射sAPPα-Tg小鼠和嚴(yán)格對照小鼠，分別于注射后12、24、48、72、96、120 小時收獲小鼠，心臟采血前首先對小鼠靜脈注射500 U肝素。心臟采集的血液使用20倍5 mm EDTA進(jìn)行稀釋，-4°C放置1小時后Coulter Counter(Beckman)進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和各種血液指標(biāo)的分析。

1.6ELISA 分離小鼠大腦組織，其中一半置于500 μl 含有 50 mmol/L Tris-HCl、pH7.6、0.01%NP-40、150 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA、0.1%SDS、1 mmol/L苯甲基磺酰氟和蛋白抑制混合液(Sigma)進(jìn)行勻漿。3 000 r/min離心5分鐘后收集上清。TNF-α (R＆D Systems) 和 IL-1β (eBioscience)ELISA操作，按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 SA(Stereological analysis)按照文獻(xiàn)［4］提供方法進(jìn)行，簡單來說，漂浮的大腦切片在進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色后，每組隨意選擇其中的6片進(jìn)行計數(shù)，NeuN陽性細(xì)胞使用Nikon Eclipse 600進(jìn)行計數(shù)。小鼠體重變化曲線和大腦內(nèi)炎癥因子數(shù)據(jù)分析，使用prism4.0統(tǒng)計軟件中Nonlinear regression和t-test的方法統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1LPS導(dǎo)致sAPPα-Tg小鼠體重明顯降低 為了觀察LPS注射對sAPPα過表達(dá)小鼠影響，我們采用最簡單的體重觀察法。對sAPPα-Tg小鼠和相應(yīng)對照小鼠進(jìn)行LPS注射，注射后每天稱重、記錄，直至20天。如圖1所示，sAPPα-Tg小鼠體重明顯降低，與正常小鼠有著顯著性差異。sAPPα-Tg小鼠從出生到3周神經(jīng)發(fā)育完全時，并無任何行為學(xué)改變或者病理學(xué)改變提示這種小鼠患孤獨(dú)癥，因此，sAPPα過表達(dá)的小鼠實(shí)際上代表了一種潛在的孤獨(dú)癥發(fā)病者，LPS的注射模擬在小兒發(fā)育過程中一種感染因素、一種誘因。圖中轉(zhuǎn)基因小鼠體重的改變，提示細(xì)菌感染，或者是天然免疫系統(tǒng)反應(yīng)或許是一種誘發(fā)具有孤獨(dú)癥發(fā)病潛質(zhì)的兒童發(fā)病的始動因素。

圖1 LPS注射顯著降低sAPPα轉(zhuǎn)基因小鼠體重Fig．1 sAPPα over-expression decrease body weight after LPS injection

2.2LPS導(dǎo)致sAPPα-Tg小鼠大腦廣泛損傷 LPS注射小鼠早期體重的改變，提示天然免疫對sAPPα過表達(dá)小鼠有著很明顯的影響。因?yàn)楣陋?dú)癥的早期癥狀學(xué)診斷在實(shí)驗(yàn)小鼠模型上非常難于實(shí)施，因此我們在注射LPS 14周后收集大腦樣本，進(jìn)行免疫學(xué)組織化學(xué)染色。圖2結(jié)果表明，sAPPα-Tg小鼠大腦海馬區(qū)內(nèi)有很多無染色區(qū)，SA(Stereological analysis)表明sAPPα-Tg小鼠大腦缺損區(qū)神經(jīng)細(xì)胞計數(shù)與正常小鼠比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。初期判斷為其他類型神經(jīng)細(xì)胞的置換，考慮正是這種神經(jīng)細(xì)胞的置換，將可能導(dǎo)致小鼠行為學(xué)的改變。為了鑒別該缺損區(qū)細(xì)胞的類型，我們使用了各種神經(jīng)細(xì)胞的抗體進(jìn)行染色，但結(jié)果顯示并不符合任何一種神經(jīng)細(xì)胞的表型(數(shù)據(jù)未示)。根據(jù)缺損區(qū)的特點(diǎn)，以及周圍的血管分布，我們猜測這種無染色的缺損區(qū)有可能是一種出血、組織壞死后的纖維增生。

2.3LPS注射引起sAPPα-Tg小鼠大腦內(nèi)出血的間接證據(jù)——血液學(xué)指標(biāo)的改變 我們推測轉(zhuǎn)基因小鼠大腦內(nèi)的缺損區(qū)，是因?yàn)榻M織出血造成的，是因?yàn)閟APPα除表達(dá)于大腦組織外，還高表達(dá)于血小板上［5］。sAPPα在血小板上的表達(dá)，可以妨礙血小板的聚集形成止血栓。為了驗(yàn)證我們的推斷，采集LPS注射后不同時間點(diǎn)血液，對外周血的細(xì)胞計數(shù)和各項指標(biāo)進(jìn)行檢測、分析。檢測結(jié)果如圖3所示，sAPPα-Tg小鼠在LPS注射后早期，HCT和紅細(xì)胞減少較明顯，而對照組中則無明顯變化，HCT和紅細(xì)胞計數(shù)表明LPS可導(dǎo)致早期失血狀態(tài)。與普通失血狀態(tài)有差異的是，sAPPα-Tg小鼠的血小板改變不明顯，與對照組比較，并無統(tǒng)計學(xué)意義。也就是說，sAPPα在血小板上的過表達(dá)，促使血小板不能很好聚集形成止血栓，因?yàn)檠“逶诔鲅獱顟B(tài)的損失主要是形成止血栓，因此短期內(nèi)血液中含量改變不大。因?yàn)樽⑸涞腖PS劑量較低，所造成的出血可以很快止住，所以表現(xiàn)為血細(xì)胞計數(shù)、HCT很快恢復(fù)，而血小板含量變化不大。

圖2 sAPPα轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)細(xì)胞的損傷和丟失Fig．2 sAPPα-Tg mice have neuronal injury and loss

2.4LPS導(dǎo)致sAPPα-Tg小鼠大腦海馬區(qū)廣泛損傷后組織增生 為了鑒別缺損區(qū)是否為組織出血后的增生，我們使用了Nissl染色的方法 ，對缺損區(qū)和正常區(qū)域的細(xì)胞進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，不管是正常區(qū)域，還是缺損區(qū)域都是活細(xì)胞，但細(xì)胞形態(tài)差異很大。Nissl染色似乎建議該區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育畸形，但免疫神經(jīng)細(xì)胞化學(xué)結(jié)果(圖2)，又排除了該區(qū)域?yàn)樯窠?jīng)細(xì)胞的可能，因細(xì)胞形態(tài)細(xì)長，推測可能為纖維細(xì)胞增生修復(fù)。

2.5腦內(nèi)sAPPα過表達(dá)對LPS激發(fā)大腦內(nèi)炎癥因子釋放無影響 sAPPα-Tg小鼠大腦內(nèi)的出血可能與過激的天然免疫有關(guān)，為了證明小鼠大腦內(nèi)sAPPα過表達(dá)是否改變大腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)，我們進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)：小劑量LPS注射sAPPα-Tg小鼠和對照組后3天，分離小鼠大腦組織，勻漿并提取上清用于TNF-α、IL-1β、IL-6等前炎因子的ELISA檢測，檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因小鼠和對照組在前炎因子的釋放上無明顯差異(數(shù)據(jù)未示)，排除腦內(nèi)過表達(dá)sAPPα可引起炎性反應(yīng)的改變這一推測。

圖3 sAPPα過表達(dá)顯著降低外周血HCT值和紅細(xì)胞計數(shù)Fig．3 sAPPα over-expression decrease HCT and RBC

圖4 Neuronal dysmorphology was revealed by Nissl stainingFig．4 Nissl染色揭示神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)改變

3 討論

小兒孤獨(dú)癥(Autism)是一種近年來發(fā)病呈上升趨勢的疾病，其發(fā)病對家庭是一種災(zāi)難，因?yàn)闊o特異有效的治療方法，以及現(xiàn)有方法治療結(jié)果的不確定性，使得該病越來越得到家長和社會的關(guān)注。對小兒孤獨(dú)癥發(fā)病機(jī)制的深入研究，將為該病治療提供理論基礎(chǔ)。

小兒孤獨(dú)癥的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜：一、大量資料提示本病與遺傳有關(guān)：某些遺傳疾病，如苯丙酮尿癥脆性X染色體綜合征均常伴有孤獨(dú)癥癥狀;有些報告指出本癥患兒的同胞中有2% ～6%患本癥，較一般人口高50倍［6］;還有研究表明小兒孤獨(dú)癥患者體內(nèi)sAPP-α過表達(dá)，與調(diào)控該多肽表達(dá)基因變異有關(guān);二、有些研究發(fā)現(xiàn)孤獨(dú)癥與腦器質(zhì)性損害有關(guān)：如果這些損害發(fā)生于產(chǎn)前或圍生期，則本癥癥狀出生后即出現(xiàn);更有研究者認(rèn)為疫苗免疫所引發(fā)的免疫損傷是造小兒孤獨(dú)癥的元兇，此觀點(diǎn)曾一度使兒童父母拒絕使用疫苗免疫［7］。但面對著眾多嚴(yán)重的感染性疾病，不注射疫苗并非明智之舉。那么，疫苗免疫反應(yīng)、或者兒童時期的感染是導(dǎo)致孤獨(dú)癥發(fā)病的元兇，還是對小兒孤獨(dú)癥發(fā)生、發(fā)展起促進(jìn)作用，還是根本與本病發(fā)展不相關(guān)，這些問題需要研究者做更深入研究。

sAPP-α轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)過表達(dá) sAPP-α，模擬一種基因突變可能導(dǎo)致的小兒孤獨(dú)癥。對該小鼠的行為學(xué)、癥狀學(xué)分析表明，該小鼠模型在正常狀態(tài)下并不會自動發(fā)展為孤獨(dú)癥小鼠。sAPPα除了表達(dá)于大腦組織內(nèi)，還表達(dá)于血小板上，過表達(dá)sAPPα的血小板不易聚集成凝血栓［5］。本實(shí)驗(yàn)使用這種過表達(dá)sAPPα的小鼠作為一種潛在的孤獨(dú)癥小鼠模型，使用低劑量的LPS注射，觀察小鼠的體重改變，以及大腦內(nèi)的病理改變。

sAPPα-Tg小鼠體重在LPS注射初期體重明顯降低，說明過表達(dá)sAPPα對小鼠的生存狀態(tài)有影響，那么這種生存狀態(tài)的改變是否與孤獨(dú)癥的發(fā)生有關(guān)?分離感染LPS小鼠大腦組織，切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果如圖2所示，過表達(dá)sAPPα的小鼠出現(xiàn)了大腦海馬區(qū)組織病變，病變區(qū)各種檢測以及外周血各項指標(biāo)提示為血管出血后的組織修復(fù)。sAPPα過表達(dá)于血小板上，LPS通過TLR4激發(fā)的天然免疫可以造成組織損傷，研究也發(fā)現(xiàn)TLR4對大腦出血影響很大［8，9］。在本研究中，正常小鼠內(nèi)所激發(fā)的天然免疫對小鼠沒有影響，但在sAPPα-Tg小鼠體內(nèi)，sAPPα的過表達(dá)使得血小板很難形成凝血栓，從而導(dǎo)致大腦組織的出血區(qū)域。這種在大腦組織內(nèi)出血損傷是否是導(dǎo)致孤獨(dú)癥發(fā)病的始動因素，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。那么大腦內(nèi)過表達(dá)的sAPPα在LPS所激發(fā)的天然免疫反應(yīng)似乎影響不大，各種炎性分子釋放量并無明顯改變。

由感染所引起的機(jī)體天然免疫反應(yīng)，在一定程度上對機(jī)體發(fā)揮著保護(hù)作用，是清除微生物感染的第一道防線，但是對于具有孤獨(dú)癥發(fā)病機(jī)制的小鼠，感染或者疫苗所激發(fā)的機(jī)體天然免疫反應(yīng)，卻似乎扮演著雙刃劍的角色，在發(fā)揮對機(jī)體保護(hù)作用的前提下，對大腦組織的損害也是顯而易見的。對新生兒體檢過程中，凡是過表達(dá)sAPPα的兒童，應(yīng)該進(jìn)行有效的預(yù)防感染的措施，必要時進(jìn)行一些免疫抑制的治療，或許能減少感染對大腦組織所造成的損傷，對預(yù)防該類兒童發(fā)展成為孤獨(dú)癥也許是一種有效措施。

1 Bailey A J，Rutter M L.Autism［J］.Sci Prog，1991;75(298)：389-402.

2 Sokol D K，Chen D，F(xiàn)arlow M R et al．High levels of Alzheimer beta-amyloid precursor protein(APP)in children with severely autistic behavior and aggression ［J］.J Child Neurol，2006;21(6)：444-449.

3 Shankar G M，Li S，Mehta T H et al．Amyloid-beta protein dimers isolated directly from Alzheimer＇s brains impair synaptic plasticity and memory［J］.Nat Med，2008;14(8)：837-842.

4 Yuyan Zhu，Huayan Hou，Kavon et al．CD45 deficiency drives amyloid-β peptide oligomers and neuronal loss in Alzheimer＇s Disease mice［J］.J Neurosci，2011;31(4)：1355-1365.

5 Smirnov A，Trupp A，Henkel A W et al．Differential processing and secretion of Abeta peptides and sAPPalpha in human platelets is regulated by thrombin and prostaglandine 2［J］.Neurobiol Aging，2009;30(10)：1552-1562.

6 Ritvo E R，F(xiàn)reeman B J，Mason-Brothers A et al．Concordance for the syndrome of autism in 40 pairs of afflicted twins［J］.Am J Psychiatry，1985;142(1)：74-77.

7 Flaherty D K.The vaccine-autism connection：a public health crisis caused by unethical medical practices and fraudulent science［J］.Ann Pharmacother，2011;45(10)：1302-1304.

8 Smithason S，Moore S K，Provencio J J.Systemic administration of LPS worsens delayed deterioration associated with vasospasm after subarachnoid hemorrhage through a Myeloid cell-dependent mechanism ［J］.Neurocrit Care，2012;16(2)：327-334.

9 Sansing L H，Harris T H，Welsh F A et al．Toll-like receptor 4 contributes to poor outcome after intracerebral hemorrhage［J］.Ann Neurol，2011;70(4)：646-656.