異基因造血干細(xì)胞移植中嵌合體的STR-PCR定量檢測

喻鳳寬，符粵文，周 健，李玉富，張龑莉，房佰俊，謝 寧，魏旭東，宋永平

河南省腫瘤醫(yī)院血液科 鄭州 450003

異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo－HSCT)是目前治療惡性血液病的有效手段之一。移植后供者細(xì)胞在受者體內(nèi)的植入情況(即嵌合體的形成)能夠判斷移植是否成功。移植后各系細(xì)胞并非同時達(dá)完全嵌合狀態(tài)(complete donor chimerism，CDC)，因此動態(tài)檢測移植后細(xì)胞的嵌合狀態(tài)，觀察供者單個核細(xì)胞(mononuclear cell，MNC)、CD3+T 細(xì)胞、CD15+粒細(xì)胞的植入順序，了解其與造血恢復(fù)及疾病轉(zhuǎn)歸之間的關(guān)系，對判斷移植效果、實施早期干預(yù)及治療時機的選擇至關(guān)重要。目前，PCR擴增短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)技術(shù)(STR－PCR)已被 IBMTR推薦為 allo－HSCT后定量檢測供者細(xì)胞嵌合狀態(tài)的金標(biāo)準(zhǔn)[1]。作者用上述方法對22例allo－HSCT患者嵌合狀態(tài)進(jìn)行了連續(xù)動態(tài)觀察，報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 22例 allo－HSCT患者為2009年1月至2010年10月在河南省腫瘤醫(yī)院血液科接受治療的病例，其中HLA相合同胞間外周血干細(xì)胞移植19例，HLA相合非血緣外周血干細(xì)胞移植3例;男15例，女7例，年齡6～47歲，中位年齡28歲。病理類型:急性髓系白血病(AML)8例，急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)5例，慢性粒細(xì)胞白血病(CML)6例，惡性淋巴瘤(ML)2例，再生障礙性貧血(再障)1例。

1.2 治療方案及造血重建標(biāo)準(zhǔn) 造血重建的標(biāo)準(zhǔn)為白細(xì)胞(WBC) ＞2.0 ×109L－1，中性粒細(xì)胞(ANC)＞0.5×109L－1和血小板(Plt)＞20×109L－1。從移植0天開始血常規(guī)監(jiān)測，1次/d，造血恢復(fù)后改為每周3次至移植后1個月。AML、CML及ML患者采用經(jīng)典BU/CY清髓性預(yù)處理方案，ALL患者采用TBI+CY預(yù)處理方案，再障患者預(yù)處理方案為Flud+BU+TBI。GVHD預(yù)防:同胞移植采用CSA+短程MTX，非血緣移植采用CSA+短程MTX+ATG+驍悉(MMF)的四聯(lián)方案。

1.3 樣本采集、細(xì)胞分選及DNA提取 術(shù)前采集供者和受者外周血或骨髓2 mL，+7 d、+14 d、+21 d和+28 d分別采集受者骨髓，EDTA抗凝，于采血后24 h內(nèi)用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，提取MNC，進(jìn)行供受者位點檢測。標(biāo)本采集后行細(xì)胞分選。采用EasySepR抗CD3單抗、抗CD15單抗，按試劑盒說明程序進(jìn)行CD3+T細(xì)胞及CD15+粒細(xì)胞分選。對得到的MNC、CD3+T細(xì)胞、CD15+粒細(xì)胞3群細(xì)胞進(jìn)行基因組DNA提取，用紫外分光光度計測定DNA，調(diào)整DNA終質(zhì)量濃度為2 mg/L。

1.4 STR-PCR 對 D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、 D3S1358、 TH01、 D13S317、 D16S539、D2S1338、D19S433、VWA、TPOX、D18S51、D5S818 和FGA 15個基因位點及1個性別位點AMEL的STR進(jìn)行PCR擴增，參考文獻(xiàn)[2]配制PCR反應(yīng)體系:擴增1.3中所得的淋巴細(xì)胞混合液20 μL+引物混合液 10 μL+Taq 酶 5 U/μL+ 模板 DNA 1 μL(2 ng)。擴增條件:預(yù)變性95℃11 min;94℃變性1 min，59℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，28個循環(huán);最后60℃延伸45 min。

1.5 嵌合狀態(tài)分析 參照文獻(xiàn)[3]的方法對STR－PCR產(chǎn)物進(jìn)行全自動毛細(xì)管電泳，并行基因掃描、分析，判讀各基因座基因型及進(jìn)行片段分析。由供受者基因型差異選擇嵌合率(DC)計算公式，代入峰下面積值計算各位點的DC，以所有位點DC的平均值[4]表示采用所有信息。當(dāng)供者細(xì)胞完全占據(jù)受者的骨髓或外周血，稱為完全的供者嵌合狀態(tài)(CDC，供者細(xì)胞＞95%);可以同時檢測到供者和受者兩種細(xì)胞成分，稱為混合嵌合狀態(tài)(MC，供者細(xì)胞占2.5% ～95%)。供者細(xì)胞＜2.5%為微嵌合體。

2 結(jié)果

2.1 移植后造血恢復(fù)情況 22例患者在移植后均順利恢復(fù)造血，ANC重建中位時間為+12 d，3例最早+9 d即達(dá)重建標(biāo)準(zhǔn)，最晚1例+18 d達(dá)重建標(biāo)準(zhǔn)。22例均不需輸注血小板，Plt重建中位時間為14 d，最快1例+10 d達(dá)重建標(biāo)準(zhǔn)，最晚有2例+21 d達(dá)重建標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 移植后嵌合體形成情況

2.2.1 骨髓MNC嵌合情況 +7 d時，骨髓MNC的平均供者嵌合率為70%，其中有1例為100%嵌合狀態(tài)，1例嵌合率最低僅47%，多數(shù)患者的嵌合率在60% ～80%。在+14 d，骨髓MNC的嵌合率有1例為88%，1例為92%，其余供者嵌合率均在95%以上。在+21 d和+28 d，骨髓MNC嵌合率均為96% ～100%，達(dá)到CDC。

2.2.2 CD15+粒細(xì)胞嵌合情況 在 +7 d時CD15+粒細(xì)胞的平均嵌合率為40%，最高者為65%，多數(shù)患者嵌合率在35% ～55%，其中1例嵌合率最低為22%。在+14 d、+21 d、+28 d嵌合率均＞95%，達(dá)到CDC。

2.2.3 CD3+T細(xì)胞的嵌合情況 在+7 d，平均嵌合率為65%，最低1例為15%，最高1例達(dá)78%，余嵌合率在50%～70%。在+14 d平均嵌合率上升達(dá)80%，最高1例為87%。+21 d，平均嵌合率達(dá)84%，多數(shù)維持在80% ～90%，其中1例達(dá)100%。在+28 d，20例達(dá)到CDC;2例為88%及90%，在+35 d這2例均達(dá)CDC。

1例SAA患者行非血緣外周造血干細(xì)胞移植，在+14 d骨髓 MNC檢測顯示 CDC，在 D8S1179、D21S11、D7S820和CSF1PO位點顯示CDC，MNC供者嵌合率100%。

2.3 移植后嵌合體與急性GVHD 22例患者中有8例(36.36%)在造血重建過程中出現(xiàn)急性GVHD，其中3例MNC、CD3+T淋巴細(xì)胞、CD15+粒細(xì)胞均達(dá)CDC，3例僅 CD3+T淋巴細(xì)胞達(dá) CDC，1例僅CD15+粒細(xì)胞達(dá) CDC，1例 CD3+T淋巴細(xì)胞、CD15+粒細(xì)胞均達(dá)CDC;+21 d 7例患者CD3+T淋巴細(xì)胞、CD15+粒細(xì)胞的供者嵌合率均＞95%，1例CD3+T淋巴細(xì)胞、CD15+粒細(xì)胞供者嵌合率分別為82%和88%。發(fā)生急性GVHDⅠ－Ⅱ級7例(其中4例單純表現(xiàn)為皮膚斑丘疹;另2例單純腹瀉，24 h腹瀉量＜500 mL/d;1例ALT增高);Ⅲ級1例。

3 討論

作者通過STR－PCR方法對allo－HSCT移植后嵌合狀態(tài)進(jìn)行了動態(tài)檢測，在移植過程中，對T細(xì)胞、粒細(xì)胞及全骨髓MNC的植入情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在+7 d均可以檢測出3類細(xì)胞的植入，T細(xì)胞的植入率(65%)略高于粒細(xì)胞的植入率(40%)，但在+14 d和+21 d以粒細(xì)胞的植入為主，T細(xì)胞植入略晚于粒細(xì)胞，與國內(nèi)外相關(guān)研究[5－7]結(jié)果一致。

臨床上對移植后的患者常采取外周血和骨髓進(jìn)行嵌合狀態(tài)的檢測，而全血和全骨髓標(biāo)本反映的主要是粒細(xì)胞的嵌合情況，很可能掩蓋了其他系列的嵌合情況[8]。作者觀察到移植后MNC供者細(xì)胞嵌合率與T淋巴細(xì)胞及粒細(xì)胞相比早期更高，+7 d即達(dá)70%，但隨后植入速度與粒細(xì)胞基本一致，稍快于T淋巴細(xì)胞，可能與MNC中含有各系細(xì)胞，供者嵌合率互相干擾有關(guān)。

STR位點的等位基因根據(jù)供受雙方彼此區(qū)別的程度可分為3種類型:Ⅰ類(雙方均為雜合子且有互不相同的等位基因)、Ⅱ類(一方為純合且與另一方的2個等位基因之一相同)、Ⅲ類(雙方等位基因完全相同)[9]。為保證供者嵌合率計算準(zhǔn)確，作者僅選?、耦愇稽c作為觀察指標(biāo)計算嵌合率，15個STR位點中每個混合樣本可檢出Ⅰ類位點5～7個。

供者細(xì)胞成功植入可以出現(xiàn)造血恢復(fù)，通過檢測嵌合狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，在骨髓抑制階段，造血恢復(fù)期，供者細(xì)胞已經(jīng)開始植入，而后造血恢復(fù)。相關(guān)研究[10]表明，分子水平植入(ME)即供者細(xì)胞嵌合率首次大于50%的時間一般比造血重建早4～7 d。該研究結(jié)果顯示，中位時間+12 d造血恢復(fù)，供者骨髓MNC在+7 d供受者細(xì)胞嵌合率達(dá)70%，CD3+T淋巴細(xì)胞 DC達(dá) 65%，與文獻(xiàn)[9]報道基本一致。CD15+粒細(xì)胞嵌合率為22% ～65%，低于50%，但后期植入迅速，可能與粒細(xì)胞植入晚于MNC、CD3+T淋巴細(xì)胞有關(guān)，也與粒細(xì)胞是判斷造血恢復(fù)的一項指標(biāo)有關(guān)，其在骨髓中增殖成熟即從分裂池到貯備池的生長時間約10～12 d，隨后釋放入血。該研究結(jié)果顯示造血恢復(fù)中位時間+12 d，與其報道相一致。

供體CD3+T淋巴細(xì)胞在急性GVHD的發(fā)生中起著最重要的作用。但移植后，供體T細(xì)胞植入較慢，受者體內(nèi)T細(xì)胞數(shù)目較少，大多處于MC，盡管其MNC及 CD15+粒細(xì)胞已達(dá) CDC，仍然急性GVHD發(fā)生率低。對于部分CD3+T淋巴細(xì)胞達(dá)CDC的患者，未出現(xiàn)急性GVHD，推測可能與移植后早期(+28 d內(nèi))通過免疫抑制劑的應(yīng)用，減慢T細(xì)胞的植入速度有關(guān)，從而避免急性GVHD發(fā)生。

總之，隨著allo－HSCT研究的不斷深入，血細(xì)胞嵌合狀態(tài)的動態(tài)監(jiān)測在早期判斷復(fù)發(fā)、評估淋巴細(xì)胞輸注的療效等多方面顯得越來越重要，而STRPCR定量檢測各細(xì)胞系的方法也逐漸被越來越廣泛地應(yīng)用。

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