卡介苗初次免疫－增強(qiáng)免疫策略抗結(jié)核病的研究進(jìn)展

陳振華 范雄林

據(jù)WHO統(tǒng)計，全球TB的發(fā)病率和新發(fā)患者數(shù)在近幾年來均呈現(xiàn)下降趨勢。2010年全球報告病例約880萬，145萬例死亡［1］，這受益于各國對TB防治的重視和新技術(shù)在TB防治上的應(yīng)用。但要實現(xiàn)TB的有效控制和WHO提出的2050年消除TB對全球公共衛(wèi)生的影響的目標(biāo)，仍面臨著幾個重大的問題：全球約1/3的人口感染了Mtb成為潛伏感染者（latent TB infection，LTBI），且5%～10%的LTBI一生中可能經(jīng)內(nèi)源性感染發(fā)展成為活動性TB患者［1］；耐多藥結(jié)核?。∕DR－TB）在TB高負(fù)擔(dān)國家流行［2］，廣泛耐藥結(jié)核病（XDR－TB）甚至完全耐藥結(jié)核?。═DR－TB）等已經(jīng)出現(xiàn)［3－5］；與 HIV 共感染，TB患者的病死率增加［6］。這些都對TB的防治提出了更高的要求。

BCG自1921年第一次應(yīng)用于人類免疫接種預(yù)防TB以來，已累計有30億人次接種，目前仍在以大約每年300萬人群的接種速率遞增［7］，對預(yù)防兒童重癥TB的發(fā)生和降低病死率起著舉足輕重的作用。盡管BCG在全世界范圍內(nèi)被如此廣泛地運(yùn)用，但并非理想的抗TB疫苗（在嬰兒出生時接種即可獲得終生的保護(hù)性免疫）。臨床試驗和流行病學(xué)調(diào)查表明，BCG對成人TB的保護(hù)效率在0%～80%之間波動［8］。產(chǎn)生這種不穩(wěn)定的免疫保護(hù)可能是由于在新生兒出生后接種BCG所誘導(dǎo)的保護(hù)性細(xì)胞免疫應(yīng)答通常僅維持10～15年，隨著免疫后時間的延長對TB的預(yù)防作用逐漸減退［9］。這也是目前TB疫情不能得到更好控制的主要原因之一。因此，加快發(fā)展新型的TB疫苗及免疫策略是緩解這一全球性公共衛(wèi)生問題的有效措施。

TB疫苗的研制思路主要在于發(fā)展比BCG誘導(dǎo)的免疫保護(hù)更強(qiáng)、保護(hù)期更長的疫苗，從而取代BCG用于免疫接種。國內(nèi)外學(xué)者通過大量的動物試驗和臨床研究，獲得了共識：目前僅2種類型的疫苗具有上述潛力。一是以BCG為基礎(chǔ) 的 改 造 BCG，如：r BCG30［10］、VPM 1002［11］、Aeras－422［12］和國內(nèi)的r BCG∶∶85B－Rv3425［13］和rBCG∶∶X等［14］，已證實在實驗動物中具有比BCG更好的保護(hù)效率。二是以Mtb為基礎(chǔ)的營養(yǎng)和（或）毒力缺失突變株，如：MtbΔRD1 Δpan CD［15］和 Mtb VAC［16］，具有與BCG相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)效率。

針對BCG免疫保護(hù)的缺陷和新型疫苗研制的困鏡，BCG的初次免疫（以下簡稱為初免）－增強(qiáng)策略（prime－boost strategy）被提出用于TB的預(yù)防。

一、同源性BCG初免－BCG增強(qiáng)策略

同源性增強(qiáng)，即用相同的疫苗再次或多次進(jìn)行加強(qiáng)免疫。鑒于目前大部分人群都已接種過BCG，因此用BCG重復(fù)免疫，以期得到更持久、更有效的保護(hù)效果。Corner等［17］在非嚙齒動物負(fù)鼠模型中用BCG初免、BCG增強(qiáng)并未發(fā)現(xiàn)任何有利的免疫反應(yīng)的改變。這一結(jié)論在小鼠模型的研究中也得到支持［18－20］。Buddle等［21］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，用 BCG重復(fù)免疫牛后，發(fā)生了更為嚴(yán)重的、肉眼可見的TB病理性改變。而且，各地人群流行病學(xué)調(diào)查對BCG重復(fù)接種的效果提供了更有說服力的證據(jù)?；仡櫺匝芯勘砻?，20世紀(jì)90年代芬蘭中斷BCG的重復(fù)接種并未對TB的發(fā)病率產(chǎn)生任何影響［22］；匈牙利和俄羅斯實施的BCG再免疫計劃，建議國民從出生到30歲期間連續(xù)接受5次BCG免疫，但沒有找到可靠的證據(jù)表明該計劃的實施有利于這些地區(qū)TB的防治［23－24］。巴西開展的一項針對7～14歲兒童的前瞻性研究表明，重復(fù)接種BCG未能使抗TB的保護(hù)性產(chǎn)生任何實質(zhì)性的提高［25］。馬拉維進(jìn)行的人群前瞻性研究也得出了相似的結(jié)果［26］。所以，盡管BCG未能增強(qiáng)BCG初免的免疫保護(hù)機(jī)制 尚 不 清 楚，WHO（1995 年）［27］和 我 國 衛(wèi) 生 部 （1997年）［28］均先后不推薦這一策略用于TB的預(yù)防。

二、BCG初免－異源性增強(qiáng)策略

既然再次免疫BCG的同源性增強(qiáng)策略沒有取得預(yù)期的效果，國內(nèi)外學(xué)者轉(zhuǎn)而探索異源性增強(qiáng)策略。異源性增強(qiáng)（heterologous boost），即用相對于初免疫苗類型不同的抗原遞送系統(tǒng)進(jìn)行加強(qiáng)免疫。疫苗類型包括亞單位蛋白疫苗、DNA免疫和活病毒載體疫苗等形式，保護(hù)性抗原以BCG與Mtb共同表達(dá)或僅Mtb表達(dá)的抗原為基礎(chǔ)。

1.亞單位蛋白疫苗增強(qiáng)：亞單位蛋白疫苗應(yīng)用于人體已經(jīng)被證實是比較安全的。它可誘導(dǎo)產(chǎn)生足夠強(qiáng)度的T細(xì)胞反應(yīng)，尤其是CD8＋T細(xì)胞反應(yīng)，但仍需要使用更高效的T細(xì)胞佐劑且須反復(fù)實施多次免疫［29－31］。2004年，GSK公司報道的抗TB候選疫苗，即Rv1196和Rv0125嵌合蛋白r Mtb72F增強(qiáng)BCG初免小鼠和豚鼠的免疫保護(hù)效果，r Mtb72F增強(qiáng)組可以減輕BCG單獨(dú)免疫組動物肺臟感染Mtb后的肺實變、促進(jìn)病損的愈合［32］。Andersen等［33］利用 CTA1－DD（由霍亂毒素A1單元酵素活性和葡萄球菌蛋白A的免疫球蛋白鍵結(jié)組成的一種口腔黏膜佐劑）作為融合蛋白Ag85B－ESAT－6的佐劑，經(jīng)鼻對小鼠反復(fù)實施增強(qiáng)免疫，結(jié)果表明：BCG和蛋白疫苗聯(lián)合應(yīng)用組的CD4＋T細(xì)胞的反應(yīng)明顯高于僅皮下注射免疫BCG組。類似的，Dietrich等［34］用大腸埃希菌不耐熱腸毒素LTK63作為Ag85B－ESAT－6的佐劑，也增強(qiáng)了BCG初免過的小鼠的保護(hù)性。Brooks等［35］用單磷酰脂（MPL）作為佐劑，聯(lián)合Ag85A注射到BCG初免的成年小鼠體內(nèi)，也可增強(qiáng)BCG抗TB的能力。然而，Majlessi等［36］用減毒百日咳桿菌腺苷環(huán)化酶－Ag85A融合蛋白或者減毒百日咳桿菌腺苷環(huán)化酶－ESAT－6融合蛋白，雖增強(qiáng)了BCG∶∶RD1初免的特異性T細(xì)胞免疫，但其抗 Mtb的保護(hù)效力不及BCG∶∶RD1單獨(dú)免疫組。Mtb主要分泌蛋白抗原85B（Ag85B）可增強(qiáng)BCG或過表達(dá)Ag85B的rBCG30初免豚鼠所誘導(dǎo)的免疫性，也并未有效地提升抗TB的保護(hù)性［37］。因此，免疫反應(yīng)的加強(qiáng)不一定與保護(hù)效力的提高呈正相關(guān)。此外，免疫保護(hù)性抗原的選擇也是亞單位疫苗異源性增強(qiáng)應(yīng)用的一個重要影響因素。例如，在不同感染狀態(tài)人群中針對Mtb黏附素之一的肝素結(jié)合血凝素（HBHA）的體液免疫與細(xì)胞免疫的反應(yīng)均不同。HBHA可刺激潛伏感染者外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生較高水平的γ干擾素（IFN－γ）。在初免過BCG的新生期和成年小鼠模型中，HBHA可明顯增強(qiáng)BCG的免疫性，且初免與增強(qiáng)的時間間隔越長，觀察到的增強(qiáng)效應(yīng)越顯著［38］。因此，加強(qiáng)篩選適用于亞單位疫苗異源性增強(qiáng)的靶抗原，以及研究保護(hù)性增強(qiáng)的機(jī)制是未來的方向。

2.DNA疫苗增強(qiáng)：多種 Mtb抗原的編碼基因已作為DNA疫苗的主要靶抗原［39］，部分免疫小鼠被證實可以提供不同程度的保護(hù)以抵抗 Mtb的攻擊［40］，但保護(hù)作用均未超過BCG。Mollenkopf等［41］最先報道Mtb Rv3407 DNA疫苗增強(qiáng)BCG初免的小鼠模型，經(jīng)過2次重復(fù)DNA疫苗免疫的小鼠對Mtb氣溶膠感染的抵抗力較BCG或DNA單獨(dú)免疫組強(qiáng)。此后，DNA疫苗異源性增強(qiáng)免疫策略日益受到關(guān)注。筆者在表達(dá)ESAT6為基礎(chǔ)的DNA疫苗和BCG聯(lián)合應(yīng)用的試驗中證實了BCG缺失而Mtb特異表達(dá)的蛋白可以用于異源性增強(qiáng)免疫策略［42］。進(jìn)一步的研究還證實以BCG缺失基因為基礎(chǔ)的融合蛋白DNA疫苗可以增強(qiáng)BCG初免小鼠或?？?Mtb感染的保護(hù)性［43－47］。表達(dá) Mtb HSP65的DNA疫苗，以及表達(dá)白細(xì)胞介素－12（IL－12）的DNA疫苗增強(qiáng)BCG初免策略，可以使獼猴抗Mtb攻擊感染的存活率達(dá)到100%［48］。

DNA疫苗具有多效性、免疫作用時間長、制造和儲藏方便、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，不過進(jìn)入人體的DNA有可能整合到基因組中，其安全性還需要更深入的研究。但并不妨礙此技術(shù)作為一種在動物模型中篩選可增強(qiáng)BCG抗Mtb的靶抗原的高效方法。

3.活病毒載體疫苗增強(qiáng)：抗TB的病毒載體疫苗目前最常用的包括痘病毒載體和腺病毒載體。痘病毒載體疫苗已經(jīng)用到HIV感染者并證實安全，改良安卡拉痘病毒（modified vaccinia virus Ankara，MVA）就是其中之一。Williams等［49］和 Verreck 等［50］在 豚 鼠 和 獼 猴 模 型 均 證 明 了 表 達(dá)Ag85A的MVA85A病毒載體疫苗增強(qiáng)BCG初免方案，不僅能獲得比BCG或MVA85A單獨(dú)免疫更強(qiáng)的特異性T細(xì)胞反應(yīng)，還具有更強(qiáng)的保護(hù)性。在英國、岡比亞和南非等地，MVA85A已進(jìn)行臨床Ⅰ期試驗，MVA85A免疫健康的未接種過BCG和接種過BCG的自愿者，均提示安全且能有效地誘導(dǎo)多功能T細(xì)胞應(yīng)答。但是，MVA85A是否能夠增強(qiáng)BCG初免產(chǎn)生的免疫反應(yīng)和放大機(jī)體自身的免疫效應(yīng)，在不同地區(qū)出現(xiàn)了差異。英國兩者均可產(chǎn)生；岡比亞和南非的接種過BCG和未接種BCG的自愿者在免疫M(jìn)VA85A前后并沒有明顯的差別，這可能與環(huán)境分枝桿菌對BCG免疫接種作用的弱化有關(guān)［51－52］。近期，南非仍在繼續(xù)開展針對無TB和HIV感染史且接種過BCG的嬰幼兒的相關(guān)研究［53］，英國則在進(jìn)一步研究將MVA85A應(yīng)用于LTBI的預(yù)防［54］。

Wang等［55］和 Xing等［56］構(gòu)建了能表達(dá) Ag85A、具有復(fù)制缺陷的重組人類腺病毒5型，即Ad Ag85A。在小鼠和豚鼠模型中驗證了Ad Ag85A可以增強(qiáng)BCG初免后產(chǎn)生的保護(hù)性免疫［57－58］，現(xiàn)已開始臨床試驗。表達(dá) Ag85A、Ag85B 和TB10.4的融合抗原蛋白的重組腺病毒疫苗AERAS－402，在南非的臨床期試驗已經(jīng)證明可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多功能T細(xì)胞，以及強(qiáng)烈而持久的CD8＋T細(xì)胞反應(yīng)，且免疫健康成年人是安全可靠的［59］。

重組病毒疫苗的優(yōu)勢在于安全，不需要佐劑，而且可以多途徑免疫接種、刺激機(jī)體產(chǎn)生廣泛而持久的CD4＋和CD8＋T細(xì)胞反應(yīng)，是未來重點研究的方向之一。

三、結(jié)論

BCG作為目前惟一應(yīng)用于臨床的預(yù)防TB的疫苗，雖然對成人的保護(hù)效果不穩(wěn)定，但它所提供的對新生兒到青少年階段的保護(hù)效力是目前任何一種非BCG為基礎(chǔ)的候選疫苗無法超越的。而且，BCG已經(jīng)納入WHO的全球擴(kuò)大免疫計劃，目前全球159個國家和地區(qū)接種BCG，覆蓋率高達(dá)90%。在今后相對長的時間內(nèi)，尚不可能有一種疫苗能夠取代BCG。探索與BCG進(jìn)行聯(lián)合免疫的增強(qiáng)方案以維持或提高人群現(xiàn)有本身的免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)，不僅有很強(qiáng)的可行性，并且符合衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)原則。目前已經(jīng)進(jìn)行臨床試驗的總共11種方案，其中8種均是采用增強(qiáng)BCG初免的策略。未來研究將更加強(qiáng)調(diào)以亞單位或重組病毒載體為基礎(chǔ)的異源性增強(qiáng)BCG初免的策略，同時將深入異源性增強(qiáng)免疫的疫苗類型、增強(qiáng)途徑和機(jī)制等方面的研究。依據(jù)目前這些策略在臨床前研究中獲得的有效性，有理由相信異源性增強(qiáng)策略將會為TB預(yù)防提供新的臨床免疫方案。

［1］WHO Library Cataloguing－in－Publication Data.Global tuberculosis control 2011［EB/OL］［2011－11－28］.http：//www.who.int/tb/publications/global＿report/en/.

［2］Zignol M，Hosseini MS，Wright A，et al.Global incidence of multidrug－resistant tuberculosis.J Infect Dis，2006，194（4）：479－485.

［3］Shah NS，Wright A，Bai GH，et al.Worldwide emergence of extensively drug－resistant tuberculosis.Emerg Infect Dis，2007，13（3）：380－387.

［4］Centers for Disease Control and Prevention（CDC）.Emergence of Mycobacterium tuberculosis with extensive resistance to second－line drugs——worldwide，2000—2004.MMWR Morb Mortal Wkly Rep，2006，55（11）：301－305.

［5］Dheda K，Migliori GB.The global rise of extensively drug－re－sistant tuberculosis：is the time to bring back sanatoria now overdue？Lancet，2011，Oct 25.［Epub ahead of print］.

［6］Fennelly KP.Variability of airborne transmission of Mycobacterium tuberculosis：implications for control of tuberculosis in the HIV era.Clin Infect Dis，2007，44 （10）：1358－1360.

［7］World Health Organization.BCG vaccine.WHO position paper［Article in English，F(xiàn)rench］.Wkly Epidemiol Rec，2004，79（4）：27－38.

［8］Fine PE.Variation in protection by BCG：implications of and for heterologous immunity.Lancet，1995，346 （8986）：1339－1345.

［9］Colditz JA，Brewer TF，Berkey CS，et al.Efficacy of BCG vaccine in the prevention of tuberculosis.Meta－analysis of the published literature.JAMA，1994，271 （9）：698－702.

［10］Tullius MV，Harth G，Maslesa－Galic S，et al.A Replication－Limited Recombinant Mycobacterium bovis BCG vaccine against tuberculosis designed for human immunodeficiency virus－positive persons is safer and more efficacious than BCG.Infect Immun，2008，76 （11）：5200－5214.

［11］Grode L，Seiler P，Baumann S，et al.Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette－Guérin mutants that secrete listeriolysin.J Clin Invest，2005，115（9）：2472－2479.

［12］Sun R，Skeiky YA，Izzo A，et al.Novel recombinant BCG expressing perfringolysin O and the over－expression of key immunodominant antigens；pre－clinical characterization，safety and protection against challenge with Mycobacterium tuberculosis.Vaccine，2009，27（33）：4412－4423.

［13］Wang J，Qie Y，Zhu B，et al.Evaluation of a recombinant BCG expressing antigen Ag85B and PPE protein Rv3425 from DNA segment RD11 of Mycobacterium tuberculosis in C57BL/6 mice.Med Microbiol Immunol，2009，198（1）：5－11.

［14］Shi C，Chen L，Chen Z，et al.Enhanced protection against tuberculosis by vaccination with recombinant BCG overexpressing HspX protein.Vaccine，2010，32（28）：5237－5244.

［15］Sambandamurthy VK，Derrick SC，Hsu T，et al.Mycobacterium tuberculosis DeltaRD1 DeltapanCD：a safe and limited replicating mutant strain that protects immunocompetent and immunocompromised mice against experimental tuberculosis.Vaccine，2006，24（37－39）：6309－6320.

［16］Asensio JA，Arbués A，Pérez E，et al.Live tuberculosis vaccines based on phoP mutants：a step towards clinical trials.Expert Opin Biol Ther，2008，8（2）：201－211.

［17］Corner LA，Buddle BM，Pfeiffer DU，et al.Vaccination of the brushtail possum（Trichosurus vulpecula）against Mycobacterium bovis infection with bacille Calmette－Guérin：the response to multiple doses.Vet Microbiol，2002，84（4）：327－336.

［18］Feng CG，Palendira U，Demangel C，et al.Priming by DNA immunization augments protective efficacy of Mycobacterium bovis bacilli Calmette－Guérin against tuberculosis.Infect Immun，2001，69（6）：4174－4176.

［19］Santosuosso M，McCormick S，Zhang X，et al.Intranasal boosting with an adenovirus－vectored vaccine markedly enhances protection by parental Mycobacerium bovis BCG immunization against pulmonary tuberculosis.Infect Immun，2006，74 （8）：4634－4643.

［20］Goonetilleke NP，McShane H，Hannan CM，et al.Enhanced immunogenecity and protective efficacy against Mycobacterium tuberculosis of bacilli Calmette－Guérin vaccine using mucosal administration and boosting with a recombinant modified vaccinia virus Ankara.J Immunol，2003，171（3）：1602－1609.

［21］Buddle BM，Wedlock DN，Parlane NA，et al.Revaccination of neonatal calves with Mycobacterium bovis BCG reduces the level of protection against bovine tuberculosis induced by a single vaccination.Infect Immun，2003，71 （11）：6411－6419.

［22］Tala－Heikkil? MM， Tuominen JE， Tala EO.Bacillus Calmette－Guérin revaccination questionable with low tubercu－losis incidence.Am J Respir Crit Care Med，1998，157 （4 Pt 1）：1324－1327.

［23］WHO.Immunization，vaccines and biologicals［EB/OL］.［2011－11－29］.http：//www.who.int/immunization/en/.

［24］Trnka L，Dankova D，Zitova J，et al.Survey of BCG vaccination policy in Europe：1994—96.Bull World Health Organ，1998，76（1）：85－91.

［25］Barreto ML，Pereira SM，Pilger D，et al.Evidence of an effect of BCG revaccination on incidence of tuberculosis in schoolaged children in Brazil：second report of the BCG－REVAC cluster－randomised trial.Vaccine，2011，29（31）：4875－4877.

［26］Karonga Prevention Trial Group.Randomised controlled trial of single BCG，repeated BCG，or combined BCG and killed Mycobacterium leprae vaccine for prevention of leprosy and tuberculosis in Malawi.Lancet，1996，348（9019）：17－24.

［27］Expanded programme on immunization.Immunization schedules in the WHO European Region，1995.Wkly Epidem Rec，1995，70（31）：221.

［28］中華人民共和國衛(wèi)生部.關(guān)于停止卡介苗復(fù)種的通知（衛(wèi)疾控發(fā)［1997］第26號）.北京，1997：1－2.

［29］Rouanet C，Locht C.Boosting BCG to protect against TB.Expert Rev Respir Med，2010，4（3）：339－348.

［30］Fletcher HA，Hawkridge T，McShane H.A New Vaccine for Tuberculosis：The Challenges of Development and Deployment.J Bioeth Inq，2009，6（2）：219－228.

［31］Kaufmann SH.How can immunology contribute to control of tuberculosis？Nat Rev Immunol，2001，1（1）：20－30.

［32］Brandt L，Skeiky YA，Alderson MR，et al.The protective effect of the Mycobacterium bovis BCG vaccine is increased by coadministration with the Mycobacterium tuberculosis 72－kilodalton fusion polyprotein Mtb72F in M .tuberculosis－infected guinea pigs.Infect Immun，2004，11（72）：6622－6632.

［33］ Andersen CS，Dietrich J，Agger EM，et al.The combined CTA1－DD/ISCOMs vector is an effective intranasal adjuvant for boosting prior Mycobacterium bovis BCG immunity to Mycobacterium tuberculosis.Infect Immun，2007，75（1）：408－416.

［34］Dietrich J，Andersen C，Rappuoli R，et al.Mucosal administration of Ag85B－ESAT－6 protects against infection with Mycobacterium tuberculosis and boosts prior bacillus Calmette－Guérin immunity.J Immunol，2006，177（9）：6353－6360.

［35］Brooks JV，F(xiàn)rank AA，Keen MA，et al.Boosting vaccine for tuberculosis.Infect Immun，2001，69 （4）：2714－2717.

［36］Majlessi L，Simsova M，Jarvis Z，et al.An increase in antimycobacterial Th1－cell responses by prime－boost protocols of immunization does not enhance protection against tuberculosis.Infect Immun，2006，74（4）：2128－2137.

［37］Horwitz MA，Harth G，Dillon BJ，et al.Enhancing the protective efficacy of Mycobacterium bovis BCG vaccination against tuberculosis by boosting with the Mycobacterium tuberculosis major secretory protein.Infect Immun，2005，73 （8）：4676－4683.

［38］Rouanet C，Debrie AS，Lecher S，et al.Subcutaneous boosting with heparin binding haemagglutinin increases BCG－induced protection against tuberculosis.Microbes Infect，2009，13（11）：995－1001.

［39］范雄林，李元，徐志凱.結(jié)核分枝桿菌基因疫苗研究進(jìn)展.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2001，17增刊：121－123.

［40］Fan X，Gao Q，F(xiàn)u R.Differential immunogenicity and protective efficacy of DNA vaccines expressing proteins of Mycobacterium tuberculosis in a mouse model.Microbiol Res，2009，16（4）：374－382.

［41］Mollenkopf HJ，Grode L，Mattow J，et al.Application of mycobacterial proteomics to vaccine design：improved protection to Mycobacterium bovis BCG prime－Rv3407 DNA boost vaccination against tuberculosis.Infect Immun，2004，72（11）：6471－6479.

［42］Fan X，Gao Q，F(xiàn)u R.DNA vaccine encoding ESAT－6 enhances the protective efficacy of BCG against Mycobacterium tuberculo－sis infection in mice.Scand J Immun，2007，66（5）：523－528.

［43］Derrick SC，Yang AL，Morris SL.A polyvalent DNA vaccine expressing an ESAT6－Ag85B fusion protein protects mice against a primary infection with Mycobacerium tuberculosis and boosts BCG induced protective immunity.Vaccine，2004，23（6），780－788.

［44］Badell E，Nicolle F，Clark S，et al.Protection against tuberculosis induced by oral prime with Mycobacterium bovis BCG and intranasal subunit boost based on the vaccine candidate Ag85BESAT－6 does not correlate with circulating IFN－gamma producing T－cells.Vaccine，2009，27（1）：28－37.

［45］Wang C，Chen Z，F(xiàn)u R，et al.A DNA vaccine expressing CFP21 and MPT64 fusion protein enhances BCG－induced protective immunity against Mycobacterium tuberculosis infection in mice.Med Microbiol Immun，2011，200（3）：165－175.

［46］Lu J，Wang C，Zhou Z，et al.Immunogenicity and protective efficacy against murine tuberculosis of a prime－boost regimen with BCG and a DNA vaccine expressing ESAT－6 and Ag85A fusion protein.Clin Dev Immunol，2011，2011：617892.

［47］Maue AC，Waters WR，Palmer MV，et al.An ESAT－6：CFP10 DNA vaccine administered in conjunction with Mycobacterium bovis BCG confers protection to cattle challenged with virulent M.bovis.Vaccine，2007，25（24）：4735－4746.

［48］Okada M，Kita Y，Nakajima T，et a1.Evaluation of a novel vaccine（HVJ－liposome/HSP65 DNA＋I(xiàn)L－12 DNA）against tuberculosis using the cynomolgus monkey model of TB.Vaccine，2007，25（16）：2990－2993.

［49］Williams A，Hatch GJ，Clark SO，et al.Evaluation of vaccines in the EU TB Vaccine Cluster using a guinea pig aerosol infection model of tuberculosis.Tuberculosis （Edinb），2005，85（1/2）：29－38.

［50］Verreck FA，Vervenne RA，Kondova I，et al.MVA.85A boosting of BCG and an attenuated，phoP deficient M.tuberculosis vaccine both show protective efficacy against tuberculosis in rhesus macaques.PLoS One，2009，4（4）：e5264.

［51］Pathan AA，Sander CR，F(xiàn)letcher HA，et al.Boosting BCG with recombinant modified vaccinia Ankara expressing antigen 85A：different boosting intervals and implications for efficacy trials.PLoS One，2007，2 （10）：e1052.

［52］Hawkridge T，Scribz TJ，Gelderbloem S，et al.Safety and immunogenicity of a new tuberculosis vaccine，MVA85A，in healthy adults in South Africa.J Infect Dis，2008，198（4）：544－552.

［53］Scriba TJ，Tameris M，Mansoor N，et al.Dose－finding study of the novel tuberculosis vaccine，MVA85A，in healthy BCG－vaccinated infants.J Infect Dis，2011，203 （12）：1832－1843.

［54］Sander CR，Pathan AA，Beveridge NE，et al.Safety and immunogenicity of a new tuberculosis vaccine，MVA85A，in Mycobacterium tuberculosis－infected individuals.Am J Respir Crit Care Med，2009，179（8）：724－733.

［55］Wang J，Thorson L，Stokes RW，et al.Single mucosal，but not parenteral，immunization with recombinant adenoviral－based vaccine provides potent protection from pulmonary tuberculosis.J Immunol，2004，173（10）：6357－6365.

［56］Xing Z，Santosuosso M，McCormick S，et al.Recent advances in the development of adenovirus－and poxvirus－vectored tuberculosis vaccine.Curr Gene Ther，2005，5（5）：485－492.

［57］Xing Z，McFarland CT，Sallenave JM，et al.Intranasal mucosal boosting with an adenovirus－vectored vaccine markedly enhances the protection of BCG－primed guinea pigs against pulmonary tuberculosis.PLoS One，2009，4（6）：e5856.

［58］Santosuosso M，McCormick S，Zhang X，et al.Intranasal boosting with an adenovirus－vectored vaccine markedly enhances protection by parenteral Mycobacterium bovis BCG immunization against pulmonary tuberculosis.Infect Immun，2006，74（8）：4634－4643.

［59］Abel B，Tameris M，Mansoor N，et al.The novel tuberculosis vaccine，AERAS－402，induces robust and polyfunctional CD4＋and CD8＋T cells in adults.Am J Respir Crit Care Med，2010，181（12）：1407－1417.