結核分枝桿菌Ag85B－ESAT－6融合蛋白重組恥垢分枝桿菌對小鼠的免疫原性研究

王平 王麗梅 張薇 柏銀蘭 康健 郝彥斐 羅泰來 徐志凱

據(jù)WHO估計全世界已有約20億人感染Mtb，其中受耐藥菌株感染者可能達到5000萬，有傳染性患者1110萬，每年新發(fā)患者約940萬，每年死亡人數(shù)高達200萬，在所有傳染病中TB死亡率僅次于AIDS［1］。WHO將TB與 AIDS、瘧疾一起列為人類最主要的傳染性殺手。BCG是用于TB預防的惟一有效疫苗，但其保護效果不理想，在不同地區(qū)免疫保護效果從0%到80%不等［2］，尤其對于成人的保護效果低下。因此，迫切需要研制新型有效的抗結核疫苗以加強對TB的預防和控制。

當前正在開發(fā)的TB新型疫苗主要包括亞單位疫苗、基因疫苗、重組BCG疫苗、減毒或增強的全菌體活疫苗及營養(yǎng)缺陷型活疫苗等。其中重組活疫苗是將編碼Mtb保護性抗原的基因導入活的微生物載體內(nèi)進行表達，一方面利用Mtb特異性的保護性抗原獲得對Mtb的保護力，另一方面利用活載體強的免疫佐劑特性加強機體產(chǎn)生的特異性免疫反應［3］。因此，在活疫苗的研究中如何獲得理想免疫效果的疫苗最關鍵的是：第一，選擇合適的具有免疫佐劑作用的載體；第二，選擇合適的靶抗原。

恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis，M.s）是一種生長較快的非致病菌分枝桿菌。研究表明M.s具有與BCG相似的免疫學特性，能夠刺激T淋巴細胞增殖，促使分泌各種細胞因子如γ干擾素（IFN－γ）、白細胞介素－2（interleukin－2，IL－2）、白細胞介素－12（interleukin－12，IL－2）等，啟動 Th1型免疫應答，提高機體對病原體的吞噬和殺滅作用等［4］。Goldstone等［5－6］將 Mtb 4種分泌型蛋白在 M.s中進行表達，結果M.s中表達的重組蛋白與天然蛋白的生物學特性幾乎完全相同，重組蛋白的表達量為BCG中的5～10倍。

Ag85B是Mtb分泌蛋白中含量最高的一個蛋白，其與Mtb的細胞壁的合成有關，并與人纖維連接蛋白結合后參與致病過程。Ag85B具有較強的免疫原性，用Ag85B蛋白或基因疫苗免疫小鼠，對小鼠感染H37Rv毒株具有免疫保護作用。比較基因組學發(fā)現(xiàn)，ESAT－6是 Mtb的毒力相關抗原，其在BCG及非致病性分枝桿菌中均缺失。研究發(fā)現(xiàn)ESAT－6亞單位疫苗能夠激發(fā)一種強的ESAT－6特異性T細胞反應保護性，與BCG作用相當；ESAT－6還是免疫回憶效應細胞的主要靶抗原之一，可在再次Mtb感染的早期，誘導其迅速增殖和釋放高水平的IFN－γ，激活單核巨噬細胞，并控制感染［7－8］。據(jù)文獻報道，用Ag85B與ESAT－6融合蛋白亞單位疫苗免疫小鼠，對小鼠具有免疫保護作用，能夠降低小鼠對毒株H37Rv的臟器荷菌數(shù)，提高小鼠存活率［9］。本課題組前期利用基因重組技術構建表達Ag85B－ESAT－6融合蛋白基因，并利用分枝桿菌表達載體將其電穿導入M.s中表達（重組M.s命名為Ag85B－ESAT 6－r M.s，專利號：CN 101875913A），結果Ag85B－ESAT－6能夠在 M.s中特異性的表達。本研究進一步評價了 Ag85B－ESAT－6－r M.s在小鼠中的免疫原性，為其用于TB新型疫苗的研究奠定基礎。

材料和方法

1.菌株、質(zhì)粒和試劑：M.s（ATCC mc2155）、BCG，分泌表達 Ag85B－ESAT－6融合蛋白的重組M.s均由本室保存。7 H9和7H10培養(yǎng)基，油酸白蛋白葡萄糖過氧化氫酶添加劑（OADC）等均購自BD公司（Becton Dickinson公司，USA）；淋巴細胞增殖 MTS［3－（4，5－dimethylthiazol－2－yl）－5（3－carboxymethoxyphenyl ）－2－（4－sulfopheny ）－2H－tetrazolium，inner salt］檢測試劑盒、細胞因子IL－2、IL－4和IFN－γ等檢測試劑盒均購自 Mabtech公司（Mabtech AB，Stockholm，Sweden）。Ag85B－ESAT－6融合蛋白由本室前期制備保存［10］。

2.實驗動物：6周齡BALB/c雌鼠，由第四軍醫(yī)大學動物中心提供。

3.小鼠免疫：6周齡雌性BALB/c小鼠50只，數(shù)字表法隨機分為5組，每組10只。各組小鼠經(jīng)背部皮下注射方式免疫，分別為生理鹽水（saline）組（0.2 ml/只），BCG 組 1×106CFU/（0.2 ml/只），M.s組1×106CFU/（0.2 ml/只），Ag85B－ESAT－6－r M.s組1×106CFU/（0.2 ml/只），Ag85B－ESAT－6融合免疫組50μg/（0.2 ml/只）。

4.小鼠外周血CD4＋和CD8＋T細胞所占百分比分析：小鼠免疫1周后開始每周采血1次，隨機抽取3只/（組/周），持續(xù)至第6周，以尾靜脈采血方式采取乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝血約300μl，用0.83%NH4Cl紅細胞裂解液裂解紅細胞制備單個淋巴細胞懸液，用p H 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml，各取100μl，加10μl熒光標記羊抗鼠單克隆抗體：異硫氰酸熒光素（FITC）標記 CD4和 R－藻紅蛋白（RPE）標記 CD8的雙抗（Becton Dickinson公司，USA））染色30 min，流式細胞儀檢測CD4＋、CD8＋T細胞所占百分比。

5.ELISPOT檢測小鼠脾淋巴細胞細胞因子：各組小鼠免疫6周后斷頸處死，無菌分離脾臟。200目銅網(wǎng)研磨制備單個脾細胞。用0.83%NH4Cl紅細胞裂解液裂解紅細胞制備脾淋巴細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為2×106個/ml。檢測細胞量為2×105個/（100μl/孔）。分別用融合蛋白 Ag85B－ESAT－6（5μg/孔），結核菌素純蛋白衍生物（PPD）（5μg/孔）和Con A蛋白（5μg/孔）進行刺激。酶聯(lián)免疫斑點檢測（enzyme－linked immunospot assay，ELISPOT）具體實驗步驟參照試劑盒說明書進行。

6.小鼠脾淋巴細胞增殖實驗：按上述實驗方法制備小鼠的脾淋巴細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml。用MTS法檢測各組小鼠脾淋巴細胞的增殖。實驗分為空白對照組（加入培養(yǎng)液）、未刺激組、Ag85B－ESAT－6蛋白刺激組（5μg/孔），PPD 蛋白刺激組（5μg/孔）和Con A蛋白陽性對照組（5μg/孔）。每組設3個復孔，各孔加入細胞1×104/100 μl，37℃ 5%CO2培養(yǎng) 72 h后，加入 MTS 20μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，酶標儀490 nm可見光波長測定吸光度，計算淋巴細胞增殖指數(shù)，增殖指數(shù)（SI）＝（試驗孔A值－空白對照孔）/（陰性未刺激對照孔－空白對照孔）。

結 果

1.免疫小鼠外周血淋巴細胞CD4＋和CD8＋T細胞所占百分比：小鼠免疫后1～6周連續(xù)尾靜脈采血，分離外周血淋巴細胞，流式細胞儀檢測CD4＋和CD8＋T細胞所占百分比。結果表明，與生理鹽水組相比，各組免疫小鼠隨著免疫時間的延長，小鼠外周血中的CD4＋和CD8＋T細胞所占比率逐漸增高（圖1）。當免疫6周后，Ag85B－ESAT－6－r M.s免疫組小鼠外周血CD4＋和CD8＋T細胞所占比率達到（59.6±1.5）%，明顯高于 BCG 免疫組［（48.8±2.3）%］（t＝12.252，P＜0.05）、M.s免疫組［（45.7±1.6）%］（t＝20.166，P＜0.05）和其他各對照免疫組 小 鼠 ［Ag85B－ESAT－6：（45.6±1.7）% （t＝19.468，P ＜0.05），saline：（27.1±1.0）% （t＝56.939，P＜0.05）］。

圖1 免疫小鼠外周血淋巴細胞中CD4＋和CD8＋T細胞所占百分比分析

2.ELISPOT檢測免疫小鼠脾淋巴細胞細胞因子產(chǎn)生水平：各組小鼠免疫6周后分離小鼠脾淋巴細胞，ELISPOT法檢測脾淋巴細胞特異性分泌IFN－γ、IL－2和IL－4等細胞因子的水平［斑點形成細胞（spot forming cells，SFC）］，結果如圖2所示。與生理鹽水組相比，各免疫組均可特異性刺激IFN－γ、IL－2和IL－4等細胞因子的分泌，且分泌IFN－γ的細胞頻數(shù)明顯高于分泌IL－2 ［（85.4±20.7）SFC/106］或IL－4［（87.8±13.7）SFC/106］的細胞頻數(shù)（t＝6.174，6.449，P＜0.05）。其中 Ag85B－ESAT－6－r M.s免疫小鼠后刺激產(chǎn)生的特異性分泌IFN－γ的細 胞 頻 數(shù) 最 高 ［（167.5±36.6）SFC/106］，與saline組［（25.3±18.1）SFC/106］、Ag85B－ESAT－6蛋白 免 疫 組 ［（48.7±17.3）SFC/106］、M.s 組［（94.6±27.1）SFC/106］和BCG組［（98.5±26.9）SFC/106］相比，差異具有統(tǒng)計學統(tǒng)計學意義［Ag85B－ESAT－6－r M.s組與對照組t檢驗，t值分別為：11.013（saline），9.280（Ag85B－ESAT－6），5.062（M.s）和4.804（BCG），P 值均＜0.05］。

圖2 免疫小鼠脾淋巴細胞產(chǎn)生IFN－γ、IL－2和IL－4等細胞因子的水平

3.免疫小鼠脾淋巴細胞增殖指數(shù)：小鼠免疫后6周，MTS法檢測免疫小鼠的脾淋巴細胞增殖指數(shù)。結果如圖3所示，Ag85B－ESAT－6－r M.s免疫小鼠后可以明顯刺激小鼠脾淋巴細胞增殖，SI為3.23±0.31，明顯高于saline組（1.16±0.26）（t＝16.179，P＜0.05）和 Ag85B－ESAT－6蛋白免疫組（2.11±0.38）（t＝7.222，P＜0.05），但與BCG免疫組（2.95±0.36）相比，其免疫小鼠的脾淋巴細胞SI差異無統(tǒng)計學意義（t＝1.864，P＞0.05）。

圖3 免疫小鼠脾淋巴細胞增殖指數(shù)

討 論

目前TB又死恢復燃，成為威脅人類健康的第一殺手。我國是全球TB高負擔國家之一，TB患者數(shù)量位居世界第二，而Mtb感染人數(shù)則位居世界第一。因此，如何能有效地預防和控制TB在我國尤其顯得迫切。

TB新型疫苗的研制是預防和控制TB感染與傳播的一個有效途徑。當前TB新型疫苗研究的種類有亞單位疫苗、基因疫苗、重組BCG、減毒或增強的全菌體活疫苗及營養(yǎng)缺陷型活疫苗等。不同種類的疫苗有著各自不同的優(yōu)缺點，其中活疫苗接種后，在體內(nèi)有一定程度的生長繁殖能力，可以模擬自然感染的過程，刺激機體產(chǎn)生全面的體液免疫、細胞免疫和局部黏膜免疫，免疫效果較高且持久。本研究評價的表達 Mtb Ag85B－ESAT－6融合蛋白的重組恥垢分枝桿菌（Ag85B－ESAT－6－r M.s）經(jīng)皮下免疫小鼠后可以有效刺激小鼠CD4＋和CD8＋T淋巴細胞的產(chǎn)生，且從免疫初始開始刺激產(chǎn)生的CD4＋和CD8＋T細胞所占百分比就明顯高于原始M.s刺激產(chǎn)生的和BCG免疫產(chǎn)生的，表明Ag85B－ESAT－6融合蛋白的加入能夠明顯增強M.s的免疫原性，且Ag85B－ESAT－6－r M.s較 BCG 能夠更快和有效地刺激產(chǎn)生CD4＋和CD8＋T細胞反應應答，這對于機體控制胞內(nèi)菌Mtb感染具有重要的意義。同時，Ag85B－ESAT－6－r M.s能夠明顯刺激小鼠脾淋巴細胞增殖，其誘生脾淋巴細胞分泌IFN－γ的水平明顯高于BCG免疫組，且分泌IFN－γ的細胞頻數(shù)也顯著高于分泌IL－2和IL－4的細胞頻數(shù)，表明Ag85BESAT－6－r M.s能夠刺激機體產(chǎn)生有利于抗 Mtb感染的免疫反應，作為TB新型候選疫苗具有一定的研究前景。

活疫苗的另一個優(yōu)點就是其接種途徑多。可通過注射、滴鼻、點眼、飲水、口服、氣霧等途徑刺激機體產(chǎn)生全面的免疫反應。因此，下一步筆者將通過不同的接種途徑、不同的免疫劑量來評價Ag85BESAT－6－r M.s重組活疫苗在小鼠模型中抗 Mtb的保護效果，進一步評價其用于TB新型候選疫苗的應用前景。

［1］World Health Organization.Tuberculosis［EB/OL］.WHO.Fact Sheet No104，2010.（2010－11－01）［2011－08－16］.http：//www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104.

［2］Wiker HG，Mustafa T，M?len H，et al.Vaccine approaches to prevent tuberculosis.Scand J Immunol，2006，64（3）：243－250.

［3］Hoyt A，Thompson MA，Moore FJ，et al.The preparation and mouse evaluation of nonviable，solvent－extracted antituberculous vaccines：（a）main assay findings；（b）stability of nonviable vaccines；（c）a major disadvantage of intravenous challenge.Am Rev Respir Dis，1967，95（5）：806－819.

［4］Falcone V，Bassey E，Jacobs W Jr，et al.The immunogenicity of recombinant Mycobacterium smegmatis bearing BCG genes.Microbiology，1995，141（Pt 5）：1239－1245.

［5］Goldstone RM，Moreland NJ，Bashiri G，et al.A new Gateway vector and expression protocol for fast and efficient recombinant protein expression in Mycobacterium smegmatis.Protein Expr Purif，2008，57（1）：81－87.

［6］Doherty TM，Olsen AW，Weischenfeld TJ，et al.Comparative analysis of different vaccine constructs expressing defined antigens from Mycobacterium tuberculosis.J Infect Dis，2004，190（12）：2146－2153.

［7］Wang LM，Shi CH，F(xiàn)an XL，et al.Expression and immunogenicity of recombinant Mycobacterium bovis Bacillus Calmette－Guérin strains secreting the antigen ESAT－6 from Mycobacterium tuberculosis in mice.Chin Med J（Engl），2007，120（14）：1220－1225.

［8］Shi CH，Wang XW，Zhang H，et al.Immune responses and protective efficacy of the gene vaccine expressing Ag85B and ESAT6 fusion protein from Mycobacterium tuberculosis.DNA Cell Biol，2008，27（4）：199－207.

［9］Dietrich J，Aagaard C，Leah R，et al.Exchanging ESAT6 with TB10.4 in an Ag85B fusion molecule－based tuberculosis subunit vaccine：efficient protection and ESAT6－based sensitive monitoring of vaccine efficacy.J Immunol，2005，174（10）：6332－6339.

［10］師長宏，范雄林，徐志凱，等.結核分枝桿菌分泌蛋白Ag85BESAT6的融合表達及純化.中華結核和呼吸雜志，2004，27（2）：89－92.