卡介菌Cp G DNA復(fù)合佐劑－02系統(tǒng)（BC－C02）有效性與安全性評(píng)價(jià)

趙愛(ài)華 李鳳祥 寇麗杰 李長(zhǎng)貴 喬來(lái)艷 王鵬 陳保文 徐苗 都偉欣沈小兵 蘇城 盧錦標(biāo) 楊蕾 王國(guó)治

目前，人用疫苗應(yīng)用最廣泛、最安全的佐劑為鋁佐劑，鋁佐劑誘導(dǎo)強(qiáng)烈體液免疫反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞免疫作用則不明顯［1］。近年來(lái)新型疫苗研究中采用的重組蛋白抗原或亞單位抗原一般由于相對(duì)分子質(zhì)量小、體內(nèi)滯留時(shí)間短等原因，免疫原性弱，必須與佐劑聯(lián)用才有效，但傳統(tǒng)的鋁佐劑由于其本身固有的局限性，尤其針對(duì)細(xì)胞免疫為主的疫苗，因此人們一直致力于新型佐劑的研究，如乳化劑MF59佐劑、免疫刺激劑CpG佐劑、細(xì)胞因子白細(xì)胞介素－12（interleukin－12，IL－12）等。鑒于單一佐劑疫苗作用的局限性，聯(lián)合作用機(jī)制不同的幾種佐劑，發(fā)揮疫苗的免疫保護(hù)作用，即使用復(fù)合佐劑成為疫苗研究的新形式［2－4］，如將遞送系統(tǒng)與免疫刺激型佐劑聯(lián)合使用，不同Toll樣受體（Toll－like receptor，TLR）激動(dòng)劑的聯(lián)用等，GSK公司的佐劑系統(tǒng)（adjuvant system，AS）系列即為佐劑聯(lián)合使用，其中AS15中的佐劑種類已達(dá)4種［5－7］。

卡介菌（BCG）Cp G復(fù)合佐劑（combination adjuvants）－02系統(tǒng)（BC－C02）由生物佐劑、無(wú)機(jī)鹽佐劑及磷酸緩沖體系組成，其中的生物佐劑為從卡介菌中提取的含未甲基化CpG基序含量達(dá)到15.75%～24.75%的天然Cp G DNA［8］，相對(duì)分子質(zhì)量范圍在（1950～9750）×103之間，相對(duì)分子質(zhì)量主要集中在6500×103。鋁鹽佐劑為氫氧化鋁或其他無(wú)機(jī)鹽。由于生物佐劑富含免疫刺激成分Cp G基序，因此將其與鋁鹽及磷酸緩沖體系組成的復(fù)合佐劑系統(tǒng)命名為BC－C02，系統(tǒng)可控p H 范圍為6.6～7.4，滲透壓摩爾濃度在215～345 m Osmol/kg之間。

因此，本研究通過(guò)相關(guān)體內(nèi)、體外試驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志、細(xì)胞因子水平、抗體水平及疫苗保護(hù)效力及過(guò)敏毒性等，對(duì)復(fù)合佐劑系統(tǒng)BC－C02的有效性及安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為復(fù)合佐劑系統(tǒng)BC－C02作為一種新型疫苗佐劑候選佐劑的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)室研究基礎(chǔ)。

材料和方法

一、材料

1.材料：BC－C02佐劑系統(tǒng)，重組Ag85B蛋白，甲型H1N1流感滅活抗原、BCG疫苗、Mtb H37Rv由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。合成Cp G DNACp G7909由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。Ag85B240－260（FQDA YNA AGG HNA VFN FPP NG）多肽由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成。流感病毒A/California/07/2009株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。

2.主要試劑：γ干擾素（IFN－γ）酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)（enzyme－linked immunospot assay，ELISPOT）檢測(cè)試 劑 盒、IL－12 ELISPOT 檢 測(cè) 試 劑 盒 （瑞 典Mabtech公司生產(chǎn)），PerCP/Cy5.5－抗鼠CD19＋、抗鼠TLR－9－FITC、抗鼠F4/80－APC、Per CP－抗鼠I－A/I－E、PE－抗鼠IL－12（美國(guó) Biolegend公司生產(chǎn)），小鼠淋巴細(xì)胞分離液，人淋巴細(xì)胞分離液（中國(guó)達(dá)科為公司生產(chǎn)）。

3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí) C57BL/6小鼠和 BALB/C 小鼠，雌性，6～8周；SPF級(jí)豚鼠，250～350 g/只，同性，均由中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

二、動(dòng)物分組及免疫

甲型H1N1疫苗免疫：BALB/C小鼠分為7組，每組20只，分別為磷酸鹽緩沖液（PBS）組、H1N1低劑量組、H1N1低劑量＋CpG DNA組、H1N1中劑量組、H1N1中劑量＋Cp G DNA組、H1N1高劑量組、H1N1高劑量＋CpG DNA 組；200μl/只動(dòng)物，頭背部皮下免疫1次；分別于接種后第5、7、14、28天采靜脈血，分離血清，待測(cè)抗體水平及抗體亞類；H1N1抗原低、中、高劑量分別為0.2μg/只、1.0μg/只、5.0μg/只。

結(jié)核重組Ag85B疫苗免疫：C57BL/6小鼠分為6組，每組4只，分別為PBS組、Ag85B組、Ag85B＋Al組、Ag85B＋Cp G DNA組、Ag85B＋BC－C02組及皮內(nèi)注射用BCG組。分別于0、14、28 d頭背部皮下免疫3次，100μl/只，劑量為Ag85B抗原5μg，BCG劑量為0.01 mg。

三、方法

1.小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、人外周血單個(gè)核細(xì)胞制備：小鼠淋巴細(xì)胞分離液制備脾單個(gè)核細(xì)胞，小鼠腹腔注射1 ml 4%可溶性淀粉肉湯，3 d后收集腹腔滲出巨噬細(xì)胞，人淋巴細(xì)胞分離液制備健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞。收集的細(xì)胞以5%胎牛血清（FBS）－1640完全培養(yǎng)基重懸，根據(jù)需要調(diào)整細(xì)胞濃度。

2.流式細(xì)胞檢測(cè)：細(xì)胞體外經(jīng)Cp G DNA刺激后，使用胞外抗鼠CD19＋－Per CP/Cy5.5，抗鼠F4/80－APC、抗鼠I－A/I－E－PerCP對(duì)B細(xì)胞及巨噬細(xì)胞表面分子進(jìn)行染色。使用抗鼠 CD19＋－Per CP/Cy5.5，抗鼠TLR－9－FITC，對(duì)B細(xì)胞內(nèi)TLR－9表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，使用 抗鼠F4/80－APC染色，抗鼠TLR－9－FITC，抗鼠IL－12－PE 對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi) TLR－9、IL－12表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞儀Guava esay cyte 8HT及分析軟件為美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。

3.ELISPOT檢測(cè)分泌IL－12的細(xì)胞數(shù)：健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞加入到檢測(cè)IL－12的ELISPOT細(xì)胞培養(yǎng)板中，體外經(jīng)Cp G DNA刺激40 h后，按ELISPOT試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)分泌IL－12細(xì)胞數(shù)，ELISPOT儀為美國(guó)Cellular Technology公司產(chǎn)品。

4.甲型H1N1流感病毒血凝抑制（HI）抗體及抗體亞類檢測(cè)［9］：取50μl滅活血清，從1∶10開(kāi)始進(jìn)行2倍系列稀釋，以血凝抑制法檢測(cè)血清中HI抗體滴度，HI抗體滴度≥40認(rèn)為血清陽(yáng)轉(zhuǎn)。ELISA法檢測(cè)血清中抗原特異性IgG1、IgG2a水平?？贵w滴度以A450值高于陰性對(duì)照血清2.1倍的最高血清稀釋倍數(shù)表示。

5.H1N1疫苗保護(hù)力評(píng)價(jià)：BALB/C小鼠免疫后18 d，以 流感病毒A/California/07/2009株50μl（106TCID50）攻擊動(dòng)物，觀察14 d，記錄小鼠存活情況，計(jì)算動(dòng)物的存活天數(shù)及存活率。

6.Ag85B特異性IFN－γ分泌細(xì)胞數(shù)檢測(cè)：制備免疫后小鼠脾臟制備脾淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度另加Ag85B240－260多肽和重組Ag85B蛋白，體外刺激40 h后，按ELISPOT試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)抗原特異性IFN－γ分泌細(xì)胞數(shù)（SFC）。

7.Ag85B復(fù)合佐劑結(jié)核疫苗保護(hù)力評(píng)價(jià)：對(duì)潛伏感染Mtb H37Rv的豚鼠，分別給予Ag85B復(fù)合佐劑疫苗治療，以生理鹽水（NS）作為對(duì)照，治療結(jié)束后觀察動(dòng)物肝、脾、肺病變情況，比較陰轉(zhuǎn)率及臟器病變指數(shù)。

8.過(guò)敏毒性檢測(cè)：小鼠、豚鼠腹腔給予佐劑，檢測(cè)小鼠Ig E水平及豚鼠全身超敏反應(yīng)情況，對(duì)豚鼠全身超敏反應(yīng)結(jié)果觀察和判斷。各組在被攻擊后直至被攻擊后1 h內(nèi)，密切觀察豚鼠有無(wú)抓鼻、豎毛、呼吸困難、痙攣、休克甚至死亡等超敏癥狀，并根據(jù)反應(yīng)情況分級(jí)（0級(jí)：無(wú)明顯反應(yīng)；1級(jí)：只有輕微抓鼻、顫抖或豎毛；2級(jí)：有幾次咳嗽，有抓鼻、顫抖或豎毛；3級(jí)：多次或連續(xù)的咳嗽，伴有呼吸困難或痙攣、抽搐等；4級(jí)：痙攣、抽搐、大小便失禁、休克、死亡）。

9.數(shù)據(jù)分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用Minitab 15.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，兩組間的比較采用成組t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.Cp G DNA刺激B細(xì)胞增殖，提高B細(xì)胞內(nèi)TLR－9表達(dá)：Cp G DNA與脾細(xì)胞體外共培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD19＋B細(xì)胞比例及CD19＋TLR－9＋B細(xì)胞比例，結(jié)果見(jiàn)圖1a。由圖1a可見(jiàn)，Cp G DNA組淋巴細(xì)胞中CD19＋細(xì)胞比例高于培養(yǎng)基對(duì)照組（NCS），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝－4.40，P＜0.05）。同時(shí)CD19＋TLR－9＋B細(xì)胞比例也顯著高于NCS對(duì)照組（見(jiàn)圖1b），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝－5.92，P＜0.05）。說(shuō)明天然CpG DNA能直接刺激B細(xì)胞增殖，并提高B細(xì)胞內(nèi)TLR－9的表達(dá)，和Cp G 7909的作用類似。

2.Cp G DNA上調(diào)巨噬細(xì)胞主要組織相容性復(fù)合體（MHC）－Ⅱ類分子，提高巨噬細(xì)胞內(nèi)IL－12、TLR－9表達(dá)：Cp G DNA與巨噬細(xì)胞體外共培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞表面MHC－Ⅱ類分子及細(xì)胞內(nèi)IL－12與TLR－9的表達(dá)情況見(jiàn)圖1c。由圖1c可見(jiàn)，Cp G DNA組F4/80＋I(xiàn)－A/I－E＋雙陽(yáng)性細(xì)胞比例高于NCS對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝－4.32，P＜0.05），說(shuō)明Cp G DNA能上調(diào)巨噬細(xì)胞表面MHC－Ⅱ分子表達(dá)。CpG DNA 組F4/80＋TLR－9＋雙陽(yáng)性細(xì)胞比例高于NCS對(duì)照組（圖1d），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝－6.59，P＜0.05），說(shuō)明Cp G DNA能提高巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR－9表達(dá)。F4/80＋I(xiàn)L－12＋雙陽(yáng)性細(xì)胞比例高于NCS對(duì)照組（圖1e），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝5.88，P＜0.05），說(shuō)明Cp G DNA能促進(jìn)巨 噬 細(xì) 胞 分 泌 IL－12。CpG DNA 組 F4/80＋TLR－9＋I(xiàn)L－12＋三陽(yáng)性細(xì)胞比例高于 NCS對(duì)照組（圖1f），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝4.80，P＜0.05）。Cp G DNA對(duì)巨噬細(xì)胞作用與Cp G 7909的作用類似。

3.Cp G DNA促進(jìn)IL－12的分泌：Cp G DNA 促進(jìn)人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）IL－12的分泌（圖1g）。由圖1g可見(jiàn)，PBMC經(jīng)Cp G DNA刺激后，IL－12斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)量隨CpG DNA濃度升高而增加。低、中、高3個(gè)劑量CpG DNA組分泌IL－12的細(xì)胞數(shù)與NCS比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值均＜0.05（tl＝3.697，tm＝3.124，th＝4.829，tLPS＝5.147）。

4.Cp G DNA對(duì)H1N1抗體的影響：Cp G DNA對(duì)H1N1 HI抗體影響結(jié)果見(jiàn)圖2a、b。由圖2a、b可見(jiàn)，免疫后5 d，復(fù)合Cp G DNA低、中、高（l、m、h）3個(gè)劑量組均檢測(cè)出HI抗體，其中高劑量抗原復(fù)合Cp G DNA組動(dòng)物血清全部陽(yáng)轉(zhuǎn)，HI抗體滴度均達(dá)到40。免疫后7 d，佐劑組的動(dòng)物血清全部陽(yáng)轉(zhuǎn)，對(duì)應(yīng)的單純抗原組動(dòng)物未全部陽(yáng)轉(zhuǎn)。免疫后14 d，復(fù)合佐劑組血清HI抗體滴度均為單純抗原組2～3倍，低劑量抗原復(fù)合佐劑組抗體滴度為單純中劑量抗原組（1.0μg）的2倍，接近單純高劑量抗原組（5.0μg）水平。免疫后28 d，Cp G DNA的佐劑效果在中、高劑量組表現(xiàn)較為明顯，主要表現(xiàn)為HI抗體滴度提高。Cp G DNA對(duì)H1N1抗體亞類影響結(jié)果見(jiàn)圖2c，由圖2c可見(jiàn)，免疫后28 d，低、中、高3個(gè)抗原劑量組復(fù)合CpG DNA后，抗原特異性IgG1水平與單純抗原組差異不大，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t低＝0.00，t中＝0.87，t高＝1.00，P 值均＞0.05），而抗原特異性IgG2a水平均高于單純抗原組，其中低、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t低＝－2.82，t高＝－4.59，P值均＜0.05）。

5.Cp G DNA提高H1N1疫苗保護(hù)效力：Cp G DNA對(duì)H1N1疫苗保護(hù)效力的影響結(jié)果見(jiàn)圖2d。由圖2d可見(jiàn)，與PBS對(duì)照組比較，低劑量抗原組經(jīng)病毒攻擊后，動(dòng)物存活率提高了20%，存活時(shí)間延長(zhǎng)了1.9 d。低劑量抗原復(fù)合CpG DNA組較PBS組存活率提高了60%，存活時(shí)間延長(zhǎng)了5.0 d，比單純抗原組存活率提高了40%，存活時(shí)間延長(zhǎng)了3.1 d。而高劑量組及高劑量復(fù)合Cp G DNA組動(dòng)物存活率為100%。低量抗原組動(dòng)物存活率及存活時(shí)間較高量抗原組分別低50%及縮短3.9 d，而復(fù)合Cp G DNA的低量抗原組存活率較高量抗原組的僅低10%，存活時(shí)間僅短0.8 d。說(shuō)明Cp G DNA提高了H1N1疫苗的保護(hù)效力。

圖1 CpG DNA對(duì)淋巴細(xì)胞的免疫刺激作用

圖2 CpG DNA對(duì)H1NI疫苗的免疫佐劑作用

6.BC－C02提高分泌抗原特異性IFN－γ 細(xì)胞數(shù)：通過(guò)檢測(cè)分泌抗原特異性IFN－γ細(xì)胞數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的能力，結(jié)果見(jiàn)圖3a。結(jié)果分別為致敏細(xì)胞體外經(jīng)合成多肽Ag85B240－260，重組蛋白Ag85B刺激結(jié)果，由圖3a可見(jiàn)，無(wú)論是合成多肽Ag85B240－260，或是蛋白 Ag85B刺激，只有以 BC－C02為佐劑的疫苗組與BCG有相似的免疫結(jié)果，顯著提高了分泌抗原特異性IFN－γ細(xì)胞數(shù)量（多肽刺激Ag＋BC－C02組與 Ag組比較，t＝－6.37，P＜0.05；蛋白刺激Ag＋BC－C02組與Ag組比較，t＝－3.49，P＜0.05），而且BC－C02為佐劑的疫苗組細(xì)胞數(shù)量高于BCG組，但兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（多肽刺激組 Ag＋ BC－C02與 BCG組比較，t＝－1.36，P＞0.05，抗原刺激組 Ag＋ BC－C02與BCG組比較，t＝0.7，P＞0.05）。

圖3 復(fù)合佐劑BC－C02免疫佐劑作用

7.Ag85B－BC－C02結(jié)核疫苗保護(hù)力評(píng)價(jià)結(jié)果：Mtb潛伏感染動(dòng)物經(jīng)疫苗治療后，臟器結(jié)核病變完全轉(zhuǎn)陰的動(dòng)物達(dá)到30%（對(duì)照組動(dòng)物100%病變），而且病變指數(shù)＜30的動(dòng)物達(dá)到60%～70%，平均病變指數(shù)與NS組比較均降低（圖3b），中劑量疫苗組和NS對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝2.20，P＜0.05），低、高劑量疫苗組與對(duì)照組比較，平均病變指數(shù)降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為0.077及0.061（t低＝1.88，t高＝2.01）。

8.免疫毒理結(jié)果：Cp G DNA對(duì)小鼠的免疫毒理結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，Cp G 200μg腹腔給予小鼠，隔日1次，共3次，免疫后18 d，檢測(cè)血清中IgE水平，Cp G DNA組與陰性對(duì)照NS組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝－1.46，P＞0.05），陽(yáng)性對(duì)照組（OVA鋁復(fù)合物）血清中IgE水平均顯著高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝－8.19，P＜0.001）。同時(shí)陽(yáng)性對(duì)照組動(dòng)物給予Cp G DNA治療后，其血清中IgE水平較陽(yáng)性對(duì)照組顯著性降低（t＝－6.58，P＜0.001），說(shuō)明Cp G DNA 的治療不會(huì)引起過(guò)敏毒性，并且可以逆轉(zhuǎn)超敏反應(yīng)程度。

圖4 CpG DNA致敏動(dòng)物后，不會(huì)引起動(dòng)物血清IgE水平提高

結(jié)核復(fù)合佐劑疫苗的免疫毒理結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，牛血清白蛋白（BSA）陽(yáng)性對(duì)照組豚鼠在被攻擊后6只動(dòng)物均出現(xiàn)典型超敏癥狀并死亡；復(fù)合疫苗組和陰性對(duì)照組豚鼠被攻擊后，均未出現(xiàn)任何異常反應(yīng)，說(shuō)明Ag－BC－C02復(fù)合疫苗不會(huì)引起全身超敏反應(yīng)。

表1 豚鼠全身過(guò)敏反應(yīng)結(jié)果（各組均為6只）

討 論

眾所周知，原核生物DNA由于富含未甲基化Cp G基序而具有免疫刺激功能，為了模擬原核生物DNA免疫刺激功能，人們合成了含未甲基化Cp G基序寡核苷酸小片段（20～30個(gè)堿基），即Cp G ODN。Cp G ODN是目前研究較多的新佐劑，既能刺激細(xì)胞免疫，也能刺激體液免疫。但由于其片段較小，只模擬了原核生物DNA的部分免疫刺激功能；又由于片段小，在機(jī)體內(nèi)容易降解，為了增加穩(wěn)定性，一般進(jìn)行硫代修飾，而非天然堿基的加入，增加了其對(duì)機(jī)體作用的復(fù)雜性。與此同時(shí)，對(duì)天然Cp G DNA的免疫佐劑作用研究則相對(duì)較少。

本研究中的生物佐劑，即為從卡介菌中提取的天然Cp G，前期研究將其作為佐劑用于各種疫苗中，結(jié)果顯示生物佐劑安全、有效并且和鋁佐劑有明顯的協(xié)同作用［10－15］，而廣為應(yīng)用的鋁鹽佐劑的安全性及有效性則不言而喻。將這2種安全有效的佐劑，輔以磷酸緩沖液體系，制成一種復(fù)合佐劑系統(tǒng)——BC－C02，旨在發(fā)揮2種佐劑的協(xié)同作用，從而促進(jìn)疫苗誘導(dǎo)有效的免疫保護(hù)反應(yīng)。

結(jié)果顯示：BC－C02中生物佐劑CpG DNA能直接刺激B細(xì)胞增殖，提高B細(xì)胞內(nèi)TLR－9表達(dá)，上調(diào)巨噬細(xì)胞表面 MHC－Ⅱ類分子表達(dá)，促進(jìn)TLR－9和IL－12的分泌，其免疫刺激作用與Cp G 7909作用相似。說(shuō)明生物佐劑Cp G DNA是一種TLR－9激動(dòng)劑，而B(niǎo)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞又是體內(nèi)重要的抗原呈遞細(xì)胞；Cp G DNA提高B細(xì)胞與巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR－9表達(dá)，說(shuō)明Cp G DNA靶向抗原呈遞細(xì)胞，通過(guò)與APC細(xì)胞的TLR－9受體識(shí)別，而影響APC細(xì)胞功能。同時(shí)Cp G DNA上調(diào)巨噬細(xì)胞表面MHC－Ⅱ類分子表達(dá)，MHC－Ⅱ類分子主要功能為識(shí)別與呈遞外源性抗原肽，說(shuō)明Cp G DNA可能提高APC細(xì)胞的呈遞功能而影響后續(xù)的免疫反應(yīng)。Cp G DNA能夠促進(jìn)IL－12分泌，而IL－12有促進(jìn)初始的CD4＋T細(xì)胞分化成Th1細(xì)胞的功能，同時(shí)IL－12也是重要的抗病毒細(xì)胞因子之一，并且能增強(qiáng)激活的NK細(xì)胞和CD8＋T細(xì)胞裂解靶細(xì)胞的功能。Cp G DNA不僅能刺激小鼠細(xì)胞分泌IL－12，同時(shí)也能顯著性刺激人外周血細(xì)胞分泌IL－12，說(shuō)明Cp G DNA對(duì)動(dòng)物和人的免疫刺激作用相似，不存在種屬差異。以上結(jié)果表明，BC－C02中生物佐劑為一種TLR－9激動(dòng)劑，能刺激機(jī)體的固有免疫，具有免疫刺激功能。

將BC－C02中生物佐劑Cp G DNA與流感滅活抗原H1N1復(fù)合，結(jié)果顯示生物佐劑能促進(jìn)抗體的提前產(chǎn)生，提高抗體尤其是IgG2a的水平，并能提高動(dòng)物對(duì)抗病毒感染能力。該結(jié)果表明生物佐劑Cp G DNA本身具有免疫佐劑功能。

鋁鹽通過(guò)緩釋抗原起到佐劑作用，Cp G DNA本身固有的免疫刺激及免疫佐劑功能，為其與鋁佐劑的協(xié)同作用提供了理論基礎(chǔ)。

將BC－C02應(yīng)用于重組蛋白Ag85B結(jié)核疫苗中的結(jié)果顯示，只有復(fù)合佐劑疫苗組與BCG組致敏細(xì)胞。體外經(jīng)抗原刺激后，分泌的抗原特異性IFN－γ的細(xì)胞數(shù)量較多，并且顯著高于抗原及單獨(dú)佐劑疫苗組，且BC－C02疫苗組略高于BCG組。BCG是目前預(yù)防結(jié)核病的惟一疫苗，其通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫而預(yù)防Mtb感染；BC－C02疫苗組與BCG組有相似的免疫效果，說(shuō)明BC－C02作為疫苗佐劑，能促進(jìn)疫苗誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫反應(yīng)，而鋁鹽佐劑對(duì)細(xì)胞免疫功能不明顯。因此，復(fù)合佐劑是由鋁鹽與Cp G DNA協(xié)同作用而發(fā)揮作用的。對(duì)Mtb潛伏感染的動(dòng)物進(jìn)行治療，結(jié)果顯示，BC－C02疫苗組動(dòng)物臟器結(jié)核病變的陰轉(zhuǎn)率提高，臟器病變程度減輕，平均病變指數(shù)均低于生理鹽水對(duì)照組，說(shuō)明BC－C02佐劑能提高疫苗的保護(hù)效力，而鋁鹽佐劑疫苗對(duì)臟器病變程度影響不大［14］。因此，復(fù)合佐劑是由鋁鹽與Cp G DNA協(xié)同作用而發(fā)揮作用的。

由于生物佐劑Cp G DNA本身具有免疫刺激作用，分別對(duì)其及BC－C02進(jìn)行免疫毒理評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示生物佐劑Cp G DNA本身及復(fù)合佐劑BC－C02均不會(huì)導(dǎo)致全身超敏反應(yīng)，而且CpG DNA有降低超敏反應(yīng)程度的作用。

總之，本研究介紹的“BC－C02”系統(tǒng)，其2種主要成分均為有效的免疫佐劑，其中生物佐劑Cp G DNA既能刺激細(xì)胞免疫，也能刺激體液免疫，對(duì)細(xì)菌、病毒及寄生蟲類抗原均有免疫佐劑作用［10－15］；試驗(yàn)研究表明其對(duì)動(dòng)物無(wú)毒副作用［16－18］；同時(shí)作為卡介菌多糖核酸注射液的成分之一，其安全性也得到了有效的驗(yàn)證?？ń榫嗵呛怂嶙⑸湟菏俏覈?guó)自主研發(fā)的免疫調(diào)節(jié)劑［19］，在我國(guó)應(yīng)用已達(dá)約5億人次，未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)。而鋁鹽作為目前人用疫苗應(yīng)用最廣的佐劑，其安全性及有效性則不言而喻。因此，本研究為BC－C02應(yīng)用于新疫苗研究提供了安全、有效的基礎(chǔ)依據(jù)。

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