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    結(jié)核病新疫苗的免疫毒理學(xué)評(píng)價(jià)方法研究

    2012-01-24 11:14:20都偉欣董娜陳保文徐苗楊蕾盧錦標(biāo)沈小兵王國(guó)治
    中國(guó)防癆雜志 2012年3期
    關(guān)鍵詞:白三烯豚鼠組胺

    都偉欣 董娜 陳保文 徐苗 楊蕾 盧錦標(biāo) 沈小兵 王國(guó)治

    隨著疫苗臨床應(yīng)用中不良反應(yīng)報(bào)道越來(lái)越多,疫苗研發(fā)過(guò)程中的安全性評(píng)價(jià)日益引起人們的重視。由于疫苗的作用機(jī)理是引起機(jī)體免疫系統(tǒng)的應(yīng)答,故疫苗接種后的多數(shù)不良反應(yīng)是由免疫系統(tǒng)引起的毒性反應(yīng)[1]。為了保證疫苗在人體應(yīng)用的安全性,我國(guó)從2002年開始要求新型疫苗作臨床前的免疫毒性分析。

    疫苗的免疫毒性主要包括:免疫抑制、超敏反應(yīng)和自身免疫三大類。但其中超敏反應(yīng)最為常見,而超敏反應(yīng)中又以Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)最為常見與兇險(xiǎn)。Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)多為全身性反應(yīng),目前對(duì)其評(píng)價(jià)大多依靠全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)和被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn),所用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型仍多為大鼠和小鼠。但這些方法均主觀性較強(qiáng),并且難以量化。而豚鼠是公認(rèn)的對(duì)致敏物質(zhì)比較敏感的動(dòng)物,并且與人類Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)發(fā)病狀態(tài)較為接近[2-3]。本研究以豚鼠為過(guò)敏反應(yīng)動(dòng)物模型,初步建立了評(píng)價(jià)Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)的幾種量化檢測(cè)指標(biāo)和方法,并將建立的方法初步應(yīng)用到結(jié)核病新疫苗(恥垢疫苗)的免疫毒性評(píng)價(jià)中。

    材料和方法

    一、材料

    1.試劑和耗材:雞卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)和 Al(OH)3(0.5 mg/ml)由北京生物制品研究所惠贈(zèng)。羊抗豚鼠IgG1抗體和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗豚鼠IgG1抗體購(gòu)于Ab D Serotec公司。四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物顯色液購(gòu)于Amresco公司。豚鼠淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于天津?yàn)笊?。Hank液、刀豆球蛋白A(concanavalin A,Con A)、臺(tái)氏液、紅細(xì)胞裂解液購(gòu)于北京欣經(jīng)科生物有限公司。15及50 ml離心管、96和24孔酶標(biāo)板(Corning公司)均購(gòu)于希爾誠(chéng)公司。組胺檢測(cè)試劑盒(histamine enzyme immunoassay kit)和白三烯檢測(cè)試劑盒(leukotriene C4 EIA kit)購(gòu)于Cayman公司。其他試劑和耗材均為中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

    2.儀器:酶標(biāo)儀:Labsystems Dragon公司;離心機(jī):Eppendorf公司。

    3.豚鼠:品系:Hartley,無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí),由中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

    二、方法

    (一)豚鼠Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)模型的制備

    首先制備免疫原[含0.05 mg/ml Al(OH)3和1 mg/ml OVA],方法是取120 mg OVA溶于48 ml生理鹽水中,另取12 ml Al(OH)3與60 ml生理鹽水充分混勻后,邊振蕩邊加入已溶解的OVA,4℃振蕩過(guò)夜即可。然后將體質(zhì)量300~350 g的雄性豚鼠按照數(shù)字表法隨機(jī)分為過(guò)敏模型組和生理鹽水對(duì)照組(簡(jiǎn)稱對(duì)照組),其中過(guò)敏模型組30只,對(duì)照組15只。最后免疫豚鼠,取1 ml免疫原,過(guò)敏模型組中每只豚鼠背部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行初次免疫。此后每2周加強(qiáng)免疫1次,加強(qiáng)免疫時(shí)取1 ml同樣免疫原對(duì)每只豚鼠進(jìn)行肌內(nèi)注射,共加強(qiáng)免疫3次。對(duì)照組以生理鹽水代替免疫原對(duì)豚鼠進(jìn)行注射,注射方式同過(guò)敏模型組。

    (二)豚鼠血清總IgG1抗體檢測(cè)方法的建立

    將過(guò)敏模型組和對(duì)照組豚鼠在末次免疫后7 d進(jìn)行心臟取血并分離血清,應(yīng)用棋盤滴定法建立豚鼠血清總IgG1抗體檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)步驟為:分別以1、2、4、6、8、10μg/ml濃度的羊抗豚鼠IgG1抗體包被酶標(biāo)板。包被結(jié)束并洗板后,每孔加入200μl封閉液在室溫下進(jìn)行封閉。封閉結(jié)束并洗板后,分別加入1∶103、1∶104和1∶105稀釋的豚鼠血清,同時(shí)做空白對(duì)照和試劑對(duì)照,每孔100μl,室溫孵育2 h。孵育結(jié)束并洗板后,每孔加入200μl 1∶20 000和1∶50 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗豚鼠IgG1抗體,室溫孵育2 h。孵育結(jié)束并洗板后,每孔加入200μl TMB底物顯色液,避光孵育5 min。每孔加入50μl的2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。于酶標(biāo)儀上讀取每孔A450值。數(shù)據(jù)處理:分別計(jì)算陽(yáng)性孔與陰性對(duì)照孔的比值(P/N),按照P/N值>2.1為陽(yáng)性。

    (三)豚鼠不同組織來(lái)源的過(guò)敏性介質(zhì)(組胺和白三烯)含量檢測(cè)方法的建立

    1.外周血嗜堿粒細(xì)胞的分離和體外刺激分泌過(guò)敏性介質(zhì)方法的建立:首先從過(guò)敏模型組和對(duì)照組豚鼠中按照數(shù)字表法分別隨機(jī)選擇10只和5只進(jìn)行心臟取血,每只取血約4 ml,取血后迅速注入抗凝管中,顛倒混勻。然后應(yīng)用豚鼠淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。外周血單個(gè)核細(xì)胞分離后應(yīng)用紅細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。裂解結(jié)束后,用1 ml Hank液進(jìn)行重懸。重懸后顯微鏡下計(jì)數(shù),將細(xì)胞濃度調(diào)至1×106/ml。將調(diào)好濃度的各管細(xì)胞懸液于37℃孵育10 min后充分振蕩彈勻。每管取細(xì)胞懸液300μl,加入等量的 OVA(1 mg/ml)液進(jìn)行體外刺激分泌過(guò)敏性介質(zhì);同時(shí)每管取細(xì)胞懸液300μl,加入等量的 Con A(10μg/ml)液作陽(yáng)性對(duì)照;每管另取細(xì)胞懸液300μl,加入等量生理鹽水作陰性對(duì)照。將所有管置37℃水浴45 min進(jìn)行刺激培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后,所有管均離心,離心條件:25℃,720×g離心10 min,離心結(jié)束后取上清液即可。

    2.支氣管肺泡灌洗液收集方法的建立:按照數(shù)字表法隨機(jī)選擇過(guò)敏模型組10只和對(duì)照組豚鼠5只,在末次免疫后7 d,從后肢靜脈注射1 mg/ml OVA溶液予以激發(fā)。激發(fā)后麻醉豚鼠,進(jìn)行支氣管插管術(shù)取支氣管肺泡灌洗液。方法是用注射器緩慢注入37℃預(yù)熱的無(wú)菌生理鹽水2.5 ml,保留30 s后抽出,重復(fù)進(jìn)行4次,收集全部支氣管肺泡灌洗液,總計(jì)約10 ml。將收集的支氣管肺泡灌洗液液置無(wú)菌15 ml離心管中進(jìn)行離心,離心條件:4℃,444×g離心10 min,離心結(jié)束后取上清液即可。

    3.腹腔灌洗液中肥大細(xì)胞的分離和體外刺激分泌過(guò)敏性介質(zhì)方法的建立:按照數(shù)字表法隨機(jī)選擇過(guò)敏模型組10只和對(duì)照組豚鼠5只,末次免疫結(jié)束后斷頸處死,用20 ml臺(tái)氏液(含肝素鈉5 IU/ml)對(duì)豚鼠進(jìn)行腹腔注射吸取腹腔灌洗液。將腹腔灌洗液置于50 ml無(wú)菌離心管中進(jìn)行離心,離心條件:4℃,720×g離心15 min,離心結(jié)束后棄上清收集細(xì)胞沉淀。加入1 ml紅細(xì)胞裂解液于細(xì)胞沉淀中,4℃,444×g離心5 min,離心結(jié)束后棄上清。用臺(tái)氏液重懸細(xì)胞沉淀并洗滌細(xì)胞2次后,用1 ml臺(tái)式液重懸細(xì)胞進(jìn)行鏡下計(jì)數(shù),調(diào)細(xì)胞濃度至2×106/ml。取24孔培養(yǎng)板,每孔加入0.1 ml的OVA液(1 mg/ml)、0.9 ml臺(tái)氏液和1 ml細(xì)胞懸液體外刺激肥大細(xì)胞分泌過(guò)敏性介質(zhì)。陰性對(duì)照為每孔加入0.1 ml無(wú)菌生理鹽水、0.9 ml臺(tái)氏液和1 ml細(xì)胞懸液。加樣完畢后,將培養(yǎng)板置37℃孵箱中刺激培養(yǎng)30 min。培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行離心,離心條件:4℃,405×g離心15 min,離心結(jié)束后取上清液即可。

    4.ELISA法檢測(cè)各樣本中過(guò)敏性介質(zhì)(組胺和白三烯)的含量:(1)組胺含量的檢測(cè):應(yīng)用Histamine Enzyme Immunoassay試劑盒對(duì)上述“1~3”段中的各樣本組胺含量進(jìn)行檢測(cè)。不同來(lái)源樣本處理方式有差異,其中外周血嗜堿粒細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清液樣本用Hank液做4倍稀釋;支氣管肺泡灌洗液的上清液樣本用酶免疫試驗(yàn)(EIA)緩沖液做5倍稀釋;腹腔灌洗液中肥大細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清液樣本用臺(tái)氏液做4倍稀釋。不同樣本檢測(cè)中標(biāo)準(zhǔn)品制備所用的稀釋液與待測(cè)樣本的稀釋液相一致,即分別以Hank液、EIA緩沖液和臺(tái)氏液稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)品。檢測(cè)步驟完全按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。(2)白三烯含量的檢測(cè):應(yīng)用Leukotriene C4 EIA試劑盒對(duì)上述“1~3”段中的各樣本組白三烯含量進(jìn)行檢測(cè)。不同來(lái)源樣本處理方式有差異,其中外周血嗜堿粒細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清液樣本和腹腔灌洗液中肥大細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清液樣本直接檢測(cè);支氣管肺泡灌洗液的上清液樣本用EIA緩沖液做2倍稀釋后檢測(cè)。不同樣本檢測(cè)中標(biāo)準(zhǔn)品制備所用的稀釋液與待測(cè)樣本的所含溶液或稀釋液相一致,即分別以Hank液、EIA緩沖液和臺(tái)氏液稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)品。檢測(cè)步驟完全按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

    (四)應(yīng)用以上建立的Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)的各項(xiàng)指標(biāo)評(píng)價(jià)結(jié)核病新疫苗(恥垢疫苗)的免疫毒性

    1.動(dòng)物分組和免疫:Hartley豚鼠,雄性,體質(zhì)量300~350 g,將豚鼠按照數(shù)字表法隨機(jī)分為3組,分別為恥垢疫苗組、過(guò)敏模型陽(yáng)性組和生理鹽水陰性對(duì)照組,每組12只。恥垢疫苗組:以濃度35μg/ml的恥垢疫苗原液后腿肌內(nèi)注射豚鼠,每只0.5 ml,每2周加強(qiáng)免疫1次,共免疫4次。過(guò)敏模型陽(yáng)性組和生理鹽水陰性對(duì)照組免疫方式同豚鼠Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)模型的制備。

    2.血清中總IgG1抗體水平檢測(cè):以上各組豚鼠中按照數(shù)字表法隨機(jī)選取8只,心臟采血后分離血清。應(yīng)用“豚鼠血清總IgG1抗體檢測(cè)方法的建立”中已建立的ELISA方法檢測(cè)豚鼠血清中總IgG1抗體水平。其中羊抗豚鼠IgG1抗體包被濃度為6μg/ml,豚鼠血清稀釋度為1∶105,HRP標(biāo)記的羊抗豚鼠IgG1抗體稀釋度為1∶20 000。具體實(shí)驗(yàn)步驟同上面“豚鼠血清總IgG1抗體檢測(cè)方法的建立”段所述。

    3.不同組織來(lái)源的過(guò)敏性介質(zhì)(組胺和白三烯)評(píng)價(jià)指標(biāo)的檢測(cè):(1)不同組織來(lái)源樣本的制備:以上各組豚鼠中按照數(shù)字表法隨機(jī)選取6只,心臟取血分離外周血嗜堿粒細(xì)胞,然后進(jìn)行支氣管插管術(shù)取支氣管肺泡灌洗液。各組再按照數(shù)字表法隨機(jī)選取另外6只,經(jīng)注射器取腹腔灌洗液中分離的肥大細(xì)胞。制備過(guò)程同上面“豚鼠不同組織來(lái)源的過(guò)敏性介質(zhì)(組胺和白三烯)含量檢測(cè)方法的建立”段所述。(2)組胺含量的檢測(cè):外周血嗜堿粒細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清液樣本、支氣管肺泡灌洗液樣本和腹腔灌洗液中肥大細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清液樣本中組胺含量檢測(cè)同上面“組胺含量的檢測(cè)”段所述。(3)白三烯含量的檢測(cè):外周血嗜堿粒細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清液樣本、支氣管肺泡灌洗液樣本和腹腔灌洗液中肥大細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清液樣本中白三烯含量檢測(cè)同上面“白三烯含量的檢測(cè)”段所述。

    結(jié) 果

    一、豚鼠血清總IgG1抗體檢測(cè)方法的建立結(jié)果

    總IgG1抗體棋盤滴定結(jié)果:確定6μg/ml羊抗豚鼠IgG1抗體包被,待測(cè)血清稀釋1∶105,以及HRP標(biāo)記的羊抗豚鼠IgG1抗體稀釋1∶20 000的條件為最佳實(shí)驗(yàn)條件,以此為條件建立豚鼠血清中總IgG1抗體檢測(cè)方法。

    二、豚鼠過(guò)敏模型中不同組織來(lái)源的過(guò)敏性介質(zhì)(組胺和白三烯)含量檢測(cè)結(jié)果

    (一)組胺含量檢測(cè)結(jié)果

    1.外周血嗜堿粒細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清中組胺含量檢測(cè)結(jié)果:ELISA法檢測(cè)模型組和對(duì)照組外周血嗜堿粒細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清中的組胺含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:過(guò)敏模型組中組胺含量為(99.37±15.34)nmol/L,而對(duì)照組中組胺含量為(29.94±5.86)nmol/L。兩樣本經(jīng)t檢驗(yàn),過(guò)敏模型組中組胺含量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.60,P<0.05)。見圖1。

    圖1 過(guò)敏模型組和對(duì)照組中不同組織來(lái)源的樣本上清液組胺含量的檢測(cè)結(jié)果

    2.支氣管肺泡灌洗液上清中組胺含量檢測(cè)結(jié)果:ELISA法檢測(cè)模型組和對(duì)照組支氣管肺泡灌洗液上清中組胺含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:過(guò)敏模型組中組胺含量為(73.42±18.60)nmol/L,而對(duì)照組中組胺含量為(31.00±12.09)nmol/L。兩樣本經(jīng)t檢驗(yàn),過(guò)敏模型組中組胺含量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.41,P<0.05)。見圖1。

    3.腹腔肥大細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清中組胺含量檢測(cè)結(jié)果:ELISA法檢測(cè)模型組和對(duì)照組腹腔肥大細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清液中組胺含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:過(guò)敏模型組中組胺含量為(39.59±12.94)nmol/L,而對(duì)照組中組胺含量為(14.35±5.85)nmol/L。兩樣本經(jīng)t檢驗(yàn),過(guò)敏模型組中組胺含量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.20,P<0.05)。見圖1。

    (二)白三烯含量檢測(cè)結(jié)果

    1.外周血嗜堿粒細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清中白三烯含量檢測(cè)結(jié)果:ELISA法檢測(cè)模型組和對(duì)照組外周血嗜堿粒細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清中的白三烯含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:過(guò)敏模型組中白三烯含量為(13.09±3.87)pg/ml,而對(duì)照組中白三烯含量為(2.22±0.53)pg/ml。兩樣本經(jīng)t檢驗(yàn),過(guò)敏模型組中白三烯含量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.46,P<0.05)。見圖2。

    圖2 過(guò)敏模型組和對(duì)照組中不同組織來(lái)源的樣本上清液白三烯含量的檢測(cè)結(jié)果

    2.支氣管肺泡灌洗液上清中白三烯含量檢測(cè)結(jié)果:ELISA法檢測(cè)模型組和對(duì)照組支氣管肺泡灌洗液上清中白三烯含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:過(guò)敏模型組中白三烯含量為(123.20±16.57)pg/ml,而對(duì)照組中白三烯含量為(39.05±16.94)pg/ml。兩樣本經(jīng)t檢驗(yàn),過(guò)敏模型組中組胺含量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.15,P<0.05)。見圖2。

    3.腹腔肥大細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清中白三烯含量檢測(cè)結(jié)果:ELISA法檢測(cè)模型組和對(duì)照組腹腔肥大細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清液中白三烯含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:過(guò)敏模型組中白三烯含量為(6.79±2.58)pg/ml,而對(duì)照組中白三烯含量為(3.09±1.18)pg/ml。兩樣本經(jīng)t檢驗(yàn),過(guò)敏模型組中白三烯含量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.85,P<0.05)。見圖2。

    三、結(jié)核病新疫苗(恥垢疫苗)評(píng)價(jià)中豚鼠血清總IgG1抗體檢測(cè)結(jié)果

    ELISA法分別對(duì)生理鹽水陰性對(duì)照組、過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組和恥垢疫苗組豚鼠血清中總IgG1抗體進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:恥垢疫苗組豚鼠血清中總IgG1抗體A值為0.179±0.03,與生理鹽水陰性對(duì)照組(A 值為0.156±0.05)相近,低于過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組總IgG1水平(A值為1.768±0.13)。經(jīng)兩樣本t檢驗(yàn),恥垢疫苗組與過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=33.68,P<0.01),與生理鹽水陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.06,P>0.05)。見圖3。

    圖3 恥垢疫苗與對(duì)照組總IgG1抗體水平檢測(cè)結(jié)果

    四、結(jié)核病新疫苗(恥垢疫苗)評(píng)價(jià)中豚鼠過(guò)敏性介質(zhì)(組胺和白三烯)含量檢測(cè)結(jié)果

    (一)組胺含量檢測(cè)結(jié)果

    1.外周血嗜堿粒細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清中組胺含量檢測(cè)結(jié)果:對(duì)各組豚鼠外周血嗜堿粒細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清液中組胺含量進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:恥垢疫苗組組胺含量[(61.64±21.62)nmol/L],與生理鹽水陰性對(duì)照組[(59.22±16.55)nmol/L]相近,低于過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組的組胺含量(128.3±61.5 nmol/L)。經(jīng)兩樣本t檢驗(yàn),恥垢疫苗組與過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.50,P<0.05),與生理鹽水陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.22,P>0.05)。見圖4。

    圖4 恥垢疫苗與對(duì)照組中不同組織來(lái)源的樣本上清液組胺含量的檢測(cè)結(jié)果

    2.支氣管肺泡灌洗液上清中組胺含量檢測(cè)結(jié)果:對(duì)各組豚鼠支氣管肺泡灌洗液上清液中組胺含量進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:恥垢疫苗組組胺含量[(53.2±25.5)nmol/L ]與生理鹽水陰性對(duì)照組[(42.58±16.1)nmol/L]相近,低于過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組的組胺含量[(119.5±60.8)nmol/L]。經(jīng)兩樣本t檢驗(yàn),恥垢疫苗組與過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.46,P<0.05),與生理鹽水陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.87,P>0.05)。見圖4。

    3.腹腔肥大細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清中組胺含量檢測(cè)結(jié)果:對(duì)各組豚鼠腹腔肥大細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清中組胺含量進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:恥垢疫苗組組胺含量[(24.52±6.69)nmol/L]與生理鹽水陰性對(duì)照組[(23.08±5.56)nmol/L]相近,低于過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組的組胺含量[(44.92±14.19)nmol/L]。經(jīng)兩樣本t檢驗(yàn),恥垢疫苗組與過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.19,P<0.05),與生理鹽水陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.41,P>0.05)。見圖4。

    (二)白三烯含量檢測(cè)

    1.外周血嗜堿粒細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清中白三烯含量檢測(cè)結(jié)果:對(duì)各組豚鼠外周血嗜堿粒細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清液中白三烯含量進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:恥垢疫苗組組胺含量[(9.89±6.36)pg/ml]與生理鹽水陰性對(duì)照組[(6.91±1.92)pg/ml]相近,低于過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組的白三烯含量[(19.98±6.74)pg/ml]。經(jīng)兩樣本t檢驗(yàn),恥垢疫苗組與過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.67,P<0.05),與生理鹽水陰性對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=1.10,P>0.05)。見圖5。

    圖5 恥垢疫苗與對(duì)照組中不同組織來(lái)源的樣本上清液白三烯含量的檢測(cè)結(jié)果

    2.支氣管肺泡灌洗液上清中白三烯含量檢測(cè)結(jié)果:對(duì)各組豚鼠支氣管肺泡灌洗液上清液中白三烯含量進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:恥垢疫苗組組胺含量[(28.94±21.55)pg/ml]與生理鹽水陰性對(duì)照組[(25.39±20.14)pg/ml]相近,低于過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組的白三烯含量[(79.8±36.3)pg/ml]。經(jīng)兩樣本t檢驗(yàn),恥垢疫苗組與過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.95,P<0.05),與生理鹽水陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.29,P>0.05)。見圖5。

    3.腹腔肥大細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清中白三烯含量檢測(cè)結(jié)果:對(duì)各組豚鼠腹腔肥大細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清中白三烯含量進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:恥垢疫苗組組胺含量[(6.64±3.73)pg/ml]與生理鹽水陰性對(duì)照組[(2.73±0.68)pg/ml]相近,低于過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組的白三烯含量[(11.26±2.52)pg/ml]。經(jīng)兩樣本t檢驗(yàn),恥垢疫苗組與過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.52,P<0.05),與生理鹽水陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.53,P>0.05)。見圖5。

    討 論

    結(jié)核病新疫苗的研究一直是結(jié)核病研究領(lǐng)域的重點(diǎn),各類型的新疫苗研究進(jìn)展很快。疫苗最終將應(yīng)用于人體,其是否具有很好的安全性是疫苗審評(píng)部門和研發(fā)部門非常關(guān)注的問(wèn)題。通常疫苗的不安全性因素是接種后引發(fā)不良反應(yīng)。臨床統(tǒng)計(jì)資料顯示疫苗引起的不良反應(yīng)中以過(guò)敏反應(yīng)所占比例最大。其中,Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率較高,且最為嚴(yán)重。因此,建立Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)的動(dòng)物模型和可量化的各種免疫毒理學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo),并以此來(lái)評(píng)價(jià)結(jié)核病新疫苗或其他新疫苗的臨床前安全性將具有很重要的意義。

    國(guó)外的免疫毒理學(xué)研究中多以大鼠和小鼠作為Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)動(dòng)物模型,但評(píng)價(jià)方法缺乏可以量化的指標(biāo),具有一定的主觀性。豚鼠作為Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)最為敏感的動(dòng)物,其過(guò)敏反應(yīng)可表現(xiàn)出與人類哮喘相似的病理生理學(xué)癥狀,并且豚鼠對(duì)分枝桿菌及其相關(guān)產(chǎn)品具有高度敏感性。因此,筆者選擇豚鼠作為疫苗特別是結(jié)核病疫苗免疫毒性評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。同時(shí)建立幾種量化的檢測(cè)指標(biāo)和方法進(jìn)行疫苗的免疫毒性評(píng)價(jià)。

    過(guò)敏抗體的產(chǎn)生可以使疫苗引起毒性反應(yīng),其中IgE作為過(guò)敏反應(yīng)的主要抗體研究已較為深入和明確。然而,Ig E并不是檢測(cè)豚鼠過(guò)敏抗體的惟一指標(biāo)。近年來(lái),IgG及其亞型在過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生發(fā)展中的作用愈來(lái)愈受到重視[4-5]。有研究表明,IgG抗體,特別是IgG1抗體同樣參與了豚鼠Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng),甚至有可能是主要過(guò)敏抗體[6-7]。并且相比于IgE引起過(guò)敏反應(yīng)作用較為緩慢,IgG抗體在Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)中發(fā)生作用更加迅速、短暫。根據(jù)豚鼠IgG抗體在過(guò)敏反應(yīng)中的這一特點(diǎn),筆者選擇血清中IgG1抗體的水平作為疫苗Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)毒理學(xué)評(píng)價(jià)的血清學(xué)指標(biāo),通過(guò)ELISA棋盤滴定實(shí)驗(yàn)建立了總IgG1抗體的檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)敏模型組中的總IgG1抗體水平遠(yuǎn)高于對(duì)照組,進(jìn)一步證實(shí)IgG1抗體參與了豚鼠過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生。

    組胺和白三烯均是過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生的重要因子和炎性介質(zhì),其濃度高低可以定量反映Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)的嚴(yán)重程度[8-9]。實(shí)驗(yàn)研究中,筆者建立了激發(fā)后豚鼠支氣管肺泡灌洗液上清的收集方法、未激發(fā)豚鼠外周血嗜堿粒細(xì)胞的分離和體外刺激培養(yǎng)方法,以及腹腔灌洗液中肥大細(xì)胞分離和體外刺激培養(yǎng)的方法,并對(duì)各上清中的組胺和白三烯含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示,過(guò)敏模型組豚鼠各樣本上清中的組胺和白三烯含量均顯著高于對(duì)照組。這表明通過(guò)檢測(cè)這3種樣本中組胺和白三烯的含量,將可能成為評(píng)價(jià)疫苗是否能夠引發(fā)Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)的定量指標(biāo)。

    總IgG1抗體水平檢測(cè)、各樣本組胺和白三烯的含量檢測(cè)方法建立后,選取恥垢疫苗作為結(jié)核病新疫苗的代表,應(yīng)用已建立的方法對(duì)其進(jìn)行免疫毒性評(píng)價(jià)。免疫毒性評(píng)價(jià)除設(shè)立疫苗評(píng)價(jià)組外,同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。結(jié)果顯示恥垢疫苗組豚鼠血清總IgG1抗體水平、各樣本上清液中的組胺和白三烯含量均與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,卻與陽(yáng)性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明恥垢疫苗具有很好的臨床前安全性。恥垢疫苗是已經(jīng)取得臨床批件的疫苗,并完成了Ⅰ期臨床研究,臨床研究資料顯示其具有很好的安全性,這與本次實(shí)驗(yàn)的豚鼠模型評(píng)價(jià)結(jié)果相一致。

    實(shí)驗(yàn)研究建立了幾種可以量化的免疫毒理學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo),這將是國(guó)內(nèi)首次對(duì)疫苗可能引起的豚鼠Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)進(jìn)行客觀、可量化的評(píng)價(jià),并為今后對(duì)其他各種疫苗特別是結(jié)核病疫苗的安全性評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。

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