耐高溫的結(jié)核分枝桿菌二株

吳龍章 蔡杏珊 譚耀駒 楊建良 劉燕文 鐘炳棠 陳劍鋒

耐高溫的結(jié)核分枝桿菌二株

吳龍章 蔡杏珊 譚耀駒 楊建良 劉燕文 鐘炳棠 陳劍鋒

分枝桿菌菌型鑒定在結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)研和臨床用藥指導(dǎo)方面起到了至關(guān)重要的作用［1］，因由 Mtb或非結(jié)核分枝桿菌（non－tuberculosis Mycobacteria，NTM）引致的肺部疾病，其臨床癥狀和X線影像表現(xiàn)沒有任何的區(qū)別，但臨床治療有很大的差異甚至完全不同［2］，因此結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTC）與NTM正確的區(qū)分尤為重要。故中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會在1995年制定并于2006年再版修訂了《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》（簡稱“規(guī)程”）［3］，其中分枝桿菌的鑒定程序為結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)研和指導(dǎo)臨床用藥方面提供了可靠的業(yè)務(wù)保障。在規(guī)程中，對MTC的鑒定有明確的實驗室鑒定標(biāo)準(zhǔn)，如生長速度緩慢，不產(chǎn)色性，對硝基苯甲酸（PNB）、耐熱觸酶和吐溫－80水解試驗陰性，噻吩－2－羧酸肼（TCH）、硝酸鹽還原試驗及尿素酶分解試驗陽性，對5%NaCl不耐受等；培養(yǎng)溫度宜37℃，在28℃和42℃環(huán)境下不生長等。但筆者在對2913株分枝桿菌進行菌型鑒定時，在1736株確診為MTC株中發(fā)現(xiàn)2株（注：來自同一例患者）能在42℃高溫環(huán)境下生長的株種，現(xiàn)報道如下。

資料和方法

1.患者資料：男性，19歲。“反復(fù)咳嗽、咯痰3年”，因癥狀加重伴發(fā)熱、氣促3月余于2011年7月12日入院。入院體檢：體溫 （T）36.5 ℃，脈 搏 （P）113 次／min，呼吸 （R）24次／min；白細胞總數(shù)（WBC）18.9×109／L，中性粒細胞（N）0.8157；血紅蛋白（Hb）101.59g／L；肝腎功能無異常；尿常規(guī)示尿蛋白（＋）；X線結(jié)果顯示雙上、中、下肺野均可見結(jié)核病灶，并雙上、中肺野空洞形成；實驗室痰分枝桿菌涂片陽性（＋＋）。

2.儀器和試劑：培養(yǎng)所用的改良羅氏培養(yǎng)基和PNB、TCH、5%NaCl鑒別培養(yǎng)基，以及其他生化反應(yīng)培養(yǎng)基均按照《規(guī)程》配制［3］。確證試驗MPB64單克隆抗體［4］購自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司，DNA微列陣技術(shù)序列分析［5］試劑購自北京博奧生物有限公司。

3.檢驗方法：分別于2011年7月13日和11月9日兩次留取晨痰，利用改良羅氏培養(yǎng)基做分枝桿菌培養(yǎng)，實驗序號：1111723和1119048。并分別于2011年8月25日和2011年12月30日培養(yǎng)陽性，菌落涂片經(jīng)抗酸染色確認為分枝桿菌，后同時（2株菌株同時進行同一實驗，以下不再標(biāo)示）按照《規(guī)程》進行藥物敏感度（藥敏）試驗和菌型鑒定［3］。以 MPB64單克隆抗體［4］及DNA微列陣技術(shù)序列分析［5］試驗進行確證。

結(jié) 果

1.藥敏結(jié)果：異煙肼（H）、鏈霉素（S）、乙胺丁醇（E）、阿米卡星（Am）、克拉霉素（Clr）、左氧氟沙星（Lfx）、莫西沙星（Mfx）、丙硫異煙胺（Pto）及對氨基水楊酸異煙肼（Pa）敏感，對利福平（R）和利福布汀（Rfb）耐藥。分枝桿菌初篩試驗：PNB陰性，TCH陽性，初步定性分枝桿菌為MTC。

2.菌型鑒定結(jié)果：（1）生物化學(xué)試驗：PNB、28℃和5%NaCl不生長；耐熱觸酶和吐溫－80水解試驗陰性；TCH和硝酸鹽還原試驗，以及尿素酶分解試驗陽性；在42℃高溫環(huán)境下生長，不過其培養(yǎng)基斜面生長的菌落數(shù)比對照管（37℃）稍微稀落。（2）確證試驗：MPB64單克隆抗體及DNA微列陣技術(shù)序列分析試驗均確證這2株耐高溫株為MTC株種。（3）驗證試驗：為確保實驗結(jié)果的可靠性，在進行生物化學(xué)鑒定和確證試驗的同時，與該例患者的2株菌株一起用H37Rv株作為對照參考試驗。

討 論

分枝桿菌不同菌群的生長發(fā)育與培養(yǎng)時的溫度關(guān)系甚為密切，其中大部分NTM基本能在25～42℃環(huán)境中生長［3］；但 MTC對生長溫度條件的要求則比較苛刻［6］，宜置35～37℃溫度條件下孵育，在30℃以下或40℃以上均不能生長或很難生長；此外MTC在規(guī)程中被歸類于“結(jié)核分枝桿菌菌群”，其與 NTM 在生物特性上有所不同［3］，其中RunyonⅠ、Ⅱ群基本為產(chǎn)色性株種，而RunyonⅣ群為快速生長型；但“結(jié)核分枝桿菌菌群”與RunyonⅢ群卻有一共同點，為不產(chǎn)色性和生長緩慢型，不同之處是后者基本能在28℃環(huán)境下生長，并有部分可在42℃高溫環(huán)境中裂殖［3］；因此分枝桿菌菌群初篩可利用色源性、生長速度及溫差將MTC與NTM兩者區(qū)別。

在規(guī)程中，同樣為不產(chǎn)色性和生長緩慢并在42℃高溫環(huán)境下生長的RunyonⅢ群分枝桿菌群有［3］：鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和施氏分枝桿菌，其中前兩者能在28℃環(huán)境下裂殖，而后者只在37～42℃環(huán)境中生長；本研究中發(fā)現(xiàn)的2株耐高溫MTC株種生長所需溫度環(huán)境特性與施氏分枝桿菌一樣，同樣能在37～42℃環(huán)境中生長繁殖，這是MTC極為罕見的生物現(xiàn)象。因此這兩者的鑒別試驗非常重要。

筆者的體會是：吐溫－80水解試驗和尿素酶分解試驗是其區(qū)別的關(guān)鍵！雖然施氏分枝桿菌與絕大部分NTM一樣對PNB耐受，但有文獻報道［7］：5.21%的 MTC對PNB產(chǎn)生了耐藥性；此外施氏分枝桿菌的耐熱觸酶試驗陽性，但對H高度耐藥的MTC也呈耐熱觸酶試驗陽性的現(xiàn)象［8］；同時在規(guī)程中指出：MTC的硝酸鹽還原試驗大部分為陽性，可是牛分枝桿菌及部分非洲分枝桿菌與施氏分枝桿菌同樣為陰性。因此，一旦出現(xiàn)PNB和耐熱觸酶試驗陽性，以及硝酸鹽還原試驗陰性但為可疑MTC株種（如菌落為米黃色、形態(tài)粗糙呈菜花樣，培養(yǎng)物涂片抗酸染色呈典型索條狀，以及對一線抗結(jié)核藥物敏感）者［7，9］，吐溫－80水解試驗和尿素酶分解試驗將是其與施氏分枝桿菌區(qū)別的惟一關(guān)鍵實驗，因后者吐溫－80水解試驗陽性而尿素酶分解試驗陰性。

作者單位：510095廣州市胸科醫(yī)院呼吸疾病國家重點實驗室（結(jié)核病研究室）

此外，本研究結(jié)果表明：該2株耐高溫MTC株僅對R和Rfb耐藥，而對臨床上其他使用的常規(guī)抗結(jié)核藥物敏感，因而菌株的耐高溫特性與藥物耐藥與否沒有因果關(guān)系；同時患者在入院前后有低熱而未見39℃或以上的高體溫現(xiàn)象，從而也表明該2株耐高溫MTC株未曾有在39℃或以上高溫環(huán)境下生存過的條件，因而菌株的耐高溫特性也似乎與此沒有因果關(guān)系。

綜合上述分析，筆者認為：該2株菌株經(jīng)生物化學(xué)試驗和確證試驗后完全符合“結(jié)核分枝桿菌菌群”的所有特征，但其能在42℃高溫環(huán)境下生長，這與典型的“結(jié)核分枝桿菌菌群”又有著巨大的差異，且在同一患者同時分離出2株能耐高溫的Mtb株種，筆者檢索了有關(guān)資料（根據(jù)萬方醫(yī)學(xué)網(wǎng)和中國知網(wǎng)等中文數(shù)據(jù)庫檢索），未見有關(guān)類似的報道。這是否提示Mtb群序列排列有所改變？是今后值得我們研究的課題。

［1］吳龍章，陳素穎，曾少芳，等.廣州市12年間分枝桿菌菌型與藥物敏感性結(jié)果變遷的分析.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011，45（1）：26－29.

［2］吳龍章，蔡杏珊，關(guān)玉華，等.66例非結(jié)核分支桿菌肺病的臨床分析.中國防癆雜志，2003，25（4）：257－259.

［3］中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會.結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程.北京：中國教育文化出版社，2006：30－96.

［4］顧欣榮，陳俊林，顧德林，等.MPB64抗原檢測對分枝桿菌菌型快速鑒別的價值探討.江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009，20（3）：34－35.

［5］劉晶波，樂軍，韓敏，等.應(yīng)用微列陣技術(shù)快速鑒定常見致病性分枝桿菌.中華臨床感染病雜志，2010，3（1）：44－47.

［6］郭鈞，孟昭赫.結(jié)核病細菌學(xué).沈陽：遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，1983：23－28.

［7］吳龍章，潘美玉，劉欣，等.結(jié)核分枝桿菌對對硝基苯甲酸耐藥性的研究.中華結(jié)核和呼吸雜志，2011，34（2）：117－119.

［8］吳龍章，鐘炳棠，劉燕文，等.對《結(jié)核病診斷細菌學(xué)檢驗規(guī)程》的一點看法.中國防癆雜志，2012，34（3）：192－193.

［9］吳龍章，蔡杏珊，譚守勇.試管內(nèi)藥物抑制分支桿菌生長的觀察.廣東醫(yī)學(xué)，2001，22（6）：512－513.

2012－05－18）

（本文編輯：張曉進）

廣東省科技廳（2012A030400035）；廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目（20121A011082）