中藥復(fù)方對Lewis肺癌移植鼠腫瘤微環(huán)境中吲哚胺2，3－雙加氧酶表達(dá)的影響

王成剛 蔣霆輝 陳越 范濟(jì)輝 張微微 沈旭波

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院分部放射科，上海 200052；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院放射介入科，上海 200437）

腫瘤的免疫治療療效不理想的一個(gè)很重要的原因是與腫瘤細(xì)胞相關(guān)的免疫耐受和免疫逃逸機(jī)制的存在，機(jī)體免疫系統(tǒng)無法對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有效的識(shí)別和殺傷。吲哚胺2，3－雙加氧酶（indoleamine 2，3－dioxygenase，IDO）是人體內(nèi)肝外色氨酸代謝限速酶，最近研究［1－2］顯示多種細(xì)胞通過高表達(dá)IDO，導(dǎo)致腫瘤局部色氨酸代謝異常及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞形成，對T細(xì)胞的增殖、分化和活性產(chǎn)生影響，進(jìn)而介導(dǎo)腫瘤局部的T細(xì)胞免疫耐受。本研究通過研究中藥復(fù)方對Lewis肺癌移植鼠腫瘤微環(huán)境中IDO表達(dá)的影響，探討從傳統(tǒng)中醫(yī)藥角度開發(fā)新型IDO抑制劑的可行性。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 注射用順鉑（cisplatin，DDP）20 mg／瓶。實(shí)驗(yàn)所用中藥復(fù)方由黃芪、黨參、蜂房、仙鶴草、七葉一枝花、山萸肉、山海螺、漏蘆等組成，水煎，濃縮至生藥含量為2.0g／mL，4℃保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 近交系C57BL／6純系小鼠，64只，雌性，體質(zhì)量16～18g，4～6周齡。將制備好的Lewis肺癌細(xì)胞懸液（約含活細(xì)胞數(shù)1.5×106個(gè)／mL，由上海醫(yī)工院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）以0.2 mL／只接種于小鼠右腋皮下造模。接種后將小鼠隨機(jī)分為4組：對照組、化療組、中藥復(fù)方組（簡稱中藥組）、中藥復(fù)方加化療組（簡稱綜合組），每組16只。接種后第5天開始給藥，給藥劑量根據(jù)人鼠體表面積折合法計(jì)算。對照組以0.9%氯化鈉液0.4mL灌胃14d；化療組于給藥的第1、第3、第5天，DDP溶液1mL（含DDP 0.1mg）腹腔注射化療，同時(shí)0.9%氯化鈉液0.4mL灌胃14d；中藥組以中藥復(fù)方藥液0.4mL（含生藥0.8g）灌胃14d。綜合組的化療同化療組，中藥復(fù)方用法同中藥組。各組均每天灌胃1次。將小鼠頸椎脫臼處死，剝離腫瘤組織進(jìn)行檢測。

1.3 觀測指標(biāo)及方法

1.3.1 腫瘤體積變化 自第7天起，每3天用游標(biāo)卡尺測量每只小鼠腋下腫瘤長徑（L）和短徑（W），用Steel公式計(jì)算腫瘤體積：V＝LW2／2。處死小鼠后稱取瘤質(zhì)量，并觀察抑瘤率。抑瘤率（%）＝（空白對照組平均瘤質(zhì)量－實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量）／空白對照組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.3.2 EnVision法免疫組化 按常規(guī)進(jìn)行；腫瘤組織IDO蛋白表達(dá)水平檢測采用western blot方法進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示。2組間比較用 Mann－Whitney U檢驗(yàn)，多重比較校正檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05／6＝0.0083。

2 結(jié) 果

2.1 各組瘤質(zhì)量及抑瘤率比較 各組小鼠的成瘤率為100%，各組平均瘤質(zhì)量分別為：對照組（2.370±1.59）g，化療組（1.233±0.44）g，中藥組（2.211±0.87）g，綜合組（0.805±0.49）g。綜合組的瘤質(zhì)量顯著低于其余3組（P＜0.01），化療組與中藥組無顯差異著（P＞0.05）。抑瘤率依次分別為：中藥組31.67%，化療組64.17%，綜合組80.84%。

2.2 治療后各組IDO免疫組化OD值比較 各組治療后lweis肺癌細(xì)胞中IDO免疫組化OD值分別為：對照組（11.750±0.461），化療組（10.250±0.194），中藥組（10.562±0.182），綜合組（9.375±0.202）。4組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H＝24.887，P＜0.001）。

2.3 Westem blot法檢測IDO蛋白表達(dá)水平 采用Westem blot方法，對小鼠腫瘤組織中IDO蛋白表達(dá)水平檢測，將各樣品目的蛋白量分別除以其內(nèi)參含量，得到的數(shù)值即為內(nèi)參校正后的各樣品中目的蛋白相對含量，對照組為1.688，化療組為1.232，中藥組為1.562，綜合組為0.949。IDO在對照組中的表達(dá)顯著高于綜合組。

3 討 論

免疫逃逸是腫瘤細(xì)胞的基本特征。腫瘤細(xì)胞可表達(dá)多種機(jī)體免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別并產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的腫瘤抗原，同時(shí)，各種腫瘤細(xì)胞可通過許多途徑來逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。導(dǎo)致所謂的腫瘤免疫耐受。研究腫瘤的免疫逃逸機(jī)制對于研究腫瘤發(fā)生發(fā)展原理、提高機(jī)體免疫狀態(tài)、逆轉(zhuǎn)腫瘤的逃逸、設(shè)計(jì)新的治療策略具有極大的促進(jìn)作用。

中醫(yī)藥在這方面顯然有著自身的優(yōu)勢。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，傳承自上一輩中醫(yī)腫瘤名家的中藥經(jīng)驗(yàn)復(fù)方具有調(diào)節(jié)荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞增殖、降低腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）水平的作用。隨著對IDO和Tregs在腫瘤免疫耐受機(jī)制中的重要作用及其兩者之間相互作用關(guān)系的深入研究，眾多研究者希望將兩者結(jié)合應(yīng)用到抗腫瘤免疫治療中。

有研究［3］顯示IDO在肺癌組織中呈高表達(dá)，且與腫瘤轉(zhuǎn)移、進(jìn)展密切相關(guān)，并且化療對其表達(dá)有影響。

目前成功的細(xì)胞毒性化療正面臨腫瘤免疫耐受的挑戰(zhàn)：一是化療引起腫瘤細(xì)胞死亡釋放腫瘤相關(guān)抗原，在腫瘤抗原遞呈過程中產(chǎn)生免疫耐受；二是化療會(huì)引起階段性的淋巴細(xì)胞減少和穩(wěn)態(tài)的破壞，在此期問T細(xì)胞更易發(fā)生免疫耐受而不是免疫應(yīng)答，T細(xì)胞的免疫耐受導(dǎo)致腫瘤化療的失敗。本研究顯示，中藥復(fù)方及化療藥物順鉑均可在不同程度上影響Lewis肺癌移植鼠腫瘤組織中IDO表達(dá)水平，同時(shí)中藥復(fù)方配合化療藥物順鉑具有協(xié)同作用，對于調(diào)控肺癌微環(huán)境中IDO均顯示與單一治療相比存在一定治療優(yōu)勢。這為今后從中醫(yī)藥角度研究IDO抑制劑提供了新的思路。

［1］ Prendergast GC.Immune escape as a fundam ental trait of cancer：focus on IDO［J］.Oncogene，2008，27（28）：3889－3900.

［2］ Katz JB，Muller AJ，Prendergast GC.Indoleamine 2，3－di oxygenase in T－cell tolerance and tumoral immune escape［J］.Immunol Rev，2008，222（4）：206－221.

［3］ Sim SH，Ahn YO，Yoon J，et al.Influence of chemotherapy on nitric oxide synthase，indole－amine－2，3－dioxygenase and CD124expression in granulocytes and monocytes of non－small cell lung［J］.Cancer Sci，2012，103（2）：155－160.