微小RNA和衰老

高琴琰, 房靜遠(yuǎn)

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化疾病研究所, 上海 200001）

隨著社會逐步步入老齡化, 衰老問題日益受到人們的重視。機(jī)體各系統(tǒng)的功能會隨著年齡的增長而不斷下降, 直至最終衰老、死亡, 在這個復(fù)雜的生物過程中, 衰老始終受到多個因素的共同作用。微小RNA（microRNA, miRNA）是一類大小約21～23個堿基的非編碼單鏈小分子RNA, 它們廣泛存在于從植物、線蟲到人類的細(xì)胞中[1]。既往研究表明, 它們在生物體內(nèi)不僅僅是代謝的產(chǎn)物, 而且是機(jī)體有目的編碼RNA的重要調(diào)控分子, 參與生物體的生長、發(fā)育、衰老和死亡的調(diào)控。2005年, 耶魯大學(xué)的研究小組以線蟲作為研究對象, 利用lin-4以及l(fā)in-4的調(diào)控靶基因敲除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 突變型線蟲的壽命要明顯短于正常線蟲, 并且過量表達(dá)lin-4也可以延長線蟲的壽命。這一研究除了說明miRNA在阻止細(xì)胞過早死亡過程中能發(fā)揮作用, 同時也為miRNA調(diào)控生長發(fā)育和衰老的生物鐘機(jī)制提供了強(qiáng)有力的證據(jù)[2]。目前已經(jīng)認(rèn)識到miRNA能調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化, 促進(jìn)組織再生, 并在體外調(diào)控細(xì)胞衰老[3],而且也明確了在不同物種, 包括蠕蟲、果蠅、小鼠和人類中存在著很多相同的進(jìn)化保守的miRNA[4],但是卻不清楚在人類的衰老和相關(guān)疾病中這些miRNA是否與在蠕蟲中發(fā)揮的作用一致。

那么究竟有哪些miRNA參與了衰老這個過程,它們又是通過那些途徑來調(diào)控衰老的呢？本文將對相關(guān)內(nèi)容作一綜述。

1 miRNA和h-TERT表達(dá)

人類染色體端粒由進(jìn)化上高度保守的重復(fù)序列TTAGGG組成, 由端粒酶合成, 是維持染色體穩(wěn)定的重要因素。隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加, 端粒不斷縮短。這就是細(xì)胞衰老的端粒假說。端粒酶是一種核蛋白, 能夠利用其自身的RNA亞基作為模板, 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（telomerase reverse transcriptase, TERT）將端粒核苷酸重復(fù)序列加到染色體末端, 從而維持端粒的結(jié)構(gòu)和長度。

隨著miRNA成為基因表達(dá)調(diào)控中研究熱點(diǎn),miRNA在端粒酶表達(dá)調(diào)控中的作用也逐漸被認(rèn)識。Mitomo等[5]在研究中發(fā)現(xiàn), miR-138表達(dá)與h-TERT的表達(dá)呈負(fù)相關(guān), 在低分化甲狀腺癌細(xì)胞中, 外源性過表達(dá)miR-138可明顯下調(diào)h-TERT表達(dá), 并且轉(zhuǎn)染miR-138前體分子可抑制連接有h-TERT 3'非翻譯區(qū)（untranslated regions, UTR）的報告載體的熒光素酶表達(dá)活性, 由此他們推測, miR-138與h-TERT的mRNA 3'UTR靶點(diǎn)結(jié)合可以阻礙mRNA的有效翻譯, 從而下調(diào)h-TERT表達(dá), 最終抑制低分化甲狀腺癌細(xì)胞端粒酶活性。該項(xiàng)研究盡管沒有達(dá)到顯著性差異, 但還是為這一途徑提供了新的研究方向。同樣, Miura等[6]研究發(fā)現(xiàn), 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤A172細(xì)胞、中度分化肝細(xì)胞癌HMc-Li7細(xì)胞和低分化肝癌HLF細(xì)胞中, RGM249（編碼miRNA前體基因）的表達(dá)可抑制h-TERT基因轉(zhuǎn)錄, 降低h-TERT mRNA水平。另外, Bonifacio等[7]在人類包皮成纖維細(xì)胞BJ以及能穩(wěn)定表達(dá)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶亞基h-TERT的永生化成纖維細(xì)胞BJ-hTERT中使用miRNA基因芯片進(jìn)行分析, 結(jié)果提示, miR-143在年輕的成纖維細(xì)胞中存在異位表達(dá), 能夠誘導(dǎo)細(xì)胞生長停滯。值得注意的是, miR-143不能誘導(dǎo)BJ-hTERT細(xì)胞的生長停滯。該小組同樣報道了miR-146a也是一個獨(dú)立的、通過分泌途徑來調(diào)控細(xì)胞衰老的因素[7]。

但是目前的研究結(jié)果僅僅提示我們, miRNA可能對h-TERT起到調(diào)控, 但還沒有研究闡明miRNA是通過怎樣的機(jī)制來發(fā)揮調(diào)控作用的, 而且, 大部分的研究尚局限于腫瘤細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行, 并沒有太多來自于正常細(xì)胞的研究。因此, 對于miRNA如何通過h-TERT來調(diào)控端粒酶從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)衰老還有待于后續(xù)的研究。

2 miRNA和p53信號通路

既往研究已知, 腫瘤抑制因子p53和其相關(guān)網(wǎng)絡(luò)能夠?qū)Χ喾N癌癥相關(guān)應(yīng)激信號產(chǎn)生應(yīng)答, 這些信號包括DNA損傷、端粒酶缺失、癌基因激活、細(xì)胞因子信號亢進(jìn)及缺氧等[8]。p53激活的結(jié)果取決于應(yīng)激的類型和應(yīng)激強(qiáng)度, 可能導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞衰老和凋亡。由于p53激活后, miRNA的表達(dá)也被激活, 所以miRNA有可能對p53的功能效應(yīng)具有重要作用, 由此通過該信號通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞的衰老。

近幾年來研究相對較多, 且最為代表性的miRNA應(yīng)屬miR-34。Tarasov等[9]在骨肉瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-34可以使細(xì)胞停滯在G1期, 同時S期細(xì)胞減少,起到細(xì)胞周期阻滯作用。之后的學(xué)者也通過細(xì)胞周期和免疫雜交檢測證明, miR-34造成的G1期阻滯是通過其對細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞周期蛋白（cyclin D1）、細(xì)胞周期素依賴激酶（cyclin dependent kinase 6, CDK6）以及其他一些miR-34a的靶蛋白的抑制來實(shí)現(xiàn)的[10]。另一些研究發(fā)現(xiàn), 將miR-34a及miR-34b/c導(dǎo)入人類成纖維細(xì)胞中進(jìn)行異位過表達(dá)時, 約60%的受轉(zhuǎn)染細(xì)胞會出現(xiàn)形態(tài)學(xué)和分子水平細(xì)胞老化[11,12]。同樣,Tazawa等[13]將miR-34a轉(zhuǎn)染入人類結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞、RKO細(xì)胞和p53突變的SW480細(xì)胞后, 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞體積增大且衰老, 衰老相關(guān)的半乳糖苷酶試驗(yàn)呈陽性, 表明miR-34a可以誘發(fā)細(xì)胞衰老。但是在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞系中, miR-34a的過表達(dá)效應(yīng)表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡的增多[14-16]。Dalgard等[17]在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中進(jìn)行了細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)和活化的caspase3細(xì)胞凋亡的活性分析, 發(fā)現(xiàn)miR-34s的抑制生長功能可以在腫瘤細(xì)胞中重新激活, 促使caspase3和PARP的裂解, 誘發(fā)caspase調(diào)控的凋亡途徑。有趣的是, 在結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞系中, miR-34a過表達(dá)的主要效應(yīng)是在轉(zhuǎn)染48 h后出現(xiàn)細(xì)胞生長停滯[11], 但在轉(zhuǎn)染72 h后則發(fā)生細(xì)胞凋亡[11,18]。

多數(shù)研究表明miR-34與p53呈現(xiàn)正相關(guān), 而在該家族中, 當(dāng)屬miR-34a與p53關(guān)系最為密切。miR-34參與p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能是通過相關(guān)的靶蛋白, 細(xì)胞因子CDK4,CDK6, Cyclin E2, E2F3, E2F5, Met, Bcl-2 及原癌基因c-myc等發(fā)揮作用的[9,19-23], 由這些靶蛋白參與p53調(diào)控網(wǎng)絡(luò)從而調(diào)控細(xì)胞的生長和凋亡。但值得注意的是, 這些調(diào)控機(jī)制并不是簡單的線性相關(guān),而是可以形成反饋機(jī)制來進(jìn)行調(diào)節(jié)。例如Timmers等[24]發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)錄因子E2F1, E2F2, E2F3的激活是由依賴p53的反饋軸控制, 間接調(diào)節(jié)E2F所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制和細(xì)胞增殖; Sharma等[25]也證實(shí), E2F1-3因子通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)p53-p21軸, 從而對細(xì)胞周期和轉(zhuǎn)化進(jìn)行調(diào)節(jié)。

因此, 盡管對于miR-34家族在p53通路中下游的靶蛋白的認(rèn)識比較多, 也初步描繪了調(diào)控的機(jī)制和網(wǎng)絡(luò), 但是由于細(xì)胞周期調(diào)控的復(fù)雜性, 我們還不能全面地闡明整個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu), miR-34如何通過靶蛋白從而進(jìn)一步調(diào)控衰老仍然處于探索階段。

除了miR-34家族之外, 還有很多miRNA與p53通路有關(guān)。2010年, Wang等[26]在人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞WI-38中, 通過電離輻射誘導(dǎo)細(xì)胞早衰, 通過基因芯片確定有8個miRNA在這些早衰細(xì)胞中表達(dá), 分別是4個上調(diào)的miRNA（miR152, miR410,iR431和miR493）和4個下調(diào)的miRNA（miR155,miR20a, miR25和miR15a）。而這些miRNA可能是通過調(diào)節(jié)p53和p38下游絲裂原活化蛋白激酶通路, 從而調(diào)節(jié)p53誘導(dǎo)核蛋白1發(fā)揮作用的[26]。Sharma等[27]研究發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞中, miR221可以高度上調(diào)并存在異位表達(dá), 由此保護(hù)肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞, 防止其凋亡。這一功效是通過Bcl2蛋白家族預(yù)凋亡成員, p53上調(diào)凋亡控制器PUMA蛋白所發(fā)揮的。Ory等[28]在人類和小鼠鱗癌細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)miR193a受到p53的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子, p63和p73基因的調(diào)控, 可被p63抑制,被預(yù)凋亡p73基因亞型激活, 從而改變細(xì)胞的化療敏感性和細(xì)胞增殖及存活能力。而Afanasyeva等[29]提出, 在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中miR885-5p的表達(dá)可以抑制細(xì)胞增殖, 從而引起細(xì)胞生長周期停滯、衰老和（或）凋亡。miR885-5p可以導(dǎo)致p53蛋白的聚集并激活該途徑, 最終上調(diào)p53的靶向目標(biāo)。Xiao等[30]發(fā)現(xiàn)miR605是p53基因網(wǎng)絡(luò)的一個新成員。在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中, p53基因逃逸的p53-Mdm2的負(fù)反饋迅速積累可以引起細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡, 而miR605的轉(zhuǎn)錄與后轉(zhuǎn)錄和p53與Mdm2相關(guān), 并且可以干擾p53-Mdm2的互相作用, 形成一個正反饋以促進(jìn)p53快速聚集。其他可能與p53有關(guān)的miRNA還包括miR372, miR373, miR125等[31,32]。但是對于這些通過芯片篩選得到的miRNA或者是新近研究發(fā)現(xiàn)的可能與衰老有關(guān)的miRNA究竟是如何通過p53通路來最終起到調(diào)控細(xì)胞周期, 并由此改變細(xì)胞衰老、凋亡的過程還未得到完全的闡明。

3 miRNA和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（Rb）腫瘤抑制通路

誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的途徑, 除了P53信號通路之外,另一條較為重要的信號通路是p16INK4A-Rb通路[33]。近幾年, 也有一些學(xué)者開始對 miRNA如何影響該通路進(jìn)行了研究。

來自美國的Martinez研究組相繼報道了一些在Rb誘導(dǎo)產(chǎn)生的衰老過程中存在差異表達(dá)的miRNA。該小組在 HeLa宮頸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn), 在細(xì)胞衰老的既定模式中, miRNA的表達(dá)可以抑制人類乳頭狀瘤病毒癌基因 E7, 從而快速抑制 Rb依賴的衰老。在他們的研究中發(fā)現(xiàn), 在 Rb依賴并且誘導(dǎo)的衰老過程中共25個miRNA上調(diào), 24個miRNA下調(diào)[34-36]。miR29和 miR30家族屬于在衰老過程中上調(diào)的miRNA, 而且這一上調(diào)過程需要 Rb通路的激活。2010年, 該小組在進(jìn)一步研究中提出, 對miR29和miR30表達(dá)進(jìn)行干擾可以抑制衰老。miR29和miR30通過結(jié)合至B-Myb mRNA（也被稱為MYBL2, 可以編碼轉(zhuǎn)錄因子從而影響細(xì)胞周期）的3'UTR來調(diào)節(jié)該蛋白表達(dá), 在 Rb驅(qū)動的細(xì)胞衰老過程中發(fā)揮重要作用[37]。

Noonan等[38]證實(shí) miR499a在人類前列腺癌細(xì)胞中下調(diào), 而它所介導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞的生長停滯正是依賴Rb蛋白。同時該小組對3'UTR區(qū)域進(jìn)行了分析, 確定了細(xì)胞周期蛋白 D1（CCND1）是miR499a的直接的下游標(biāo)靶, 從而證實(shí) miR499a是Rb通路的一個重要的miRNA組成成員。

但是關(guān)于miRNA和Rb通路的研究目前還不是很多, 雖然已經(jīng)找到了一些明確的標(biāo)靶蛋白, 但是今后還需對 miRNA如何通過該通路進(jìn)行衰老的調(diào)控進(jìn)行更深入的研究, 方能闡明整個真相。

4 miRNA和一些特殊途徑

迄今為止, 很多研究都集中于探討miRNA通過降低mRNA的穩(wěn)定性和（或）影響翻譯過程從而調(diào)控mRNA的表達(dá), 最終控制不同的細(xì)胞衰老過程。但是在miRNA合成過程中也有一些重要的酶參與其中,例如Dicer和核糖核酸酶內(nèi)切酶Ⅲ。通過這些酶的調(diào)節(jié)同樣也可以調(diào)控miRNA從而影響衰老。

Damiani等[39]在小鼠的視網(wǎng)膜上敲除Dicer后,發(fā)現(xiàn)部分miRNA水平下降, 而且很快產(chǎn)生了視網(wǎng)膜的退行性病變, 證實(shí)了miRNA與這些退行性疾病有密切關(guān)聯(lián)。同樣, Sand等[40]在人類皮膚癌細(xì)胞中也證實(shí)了Dicer和Drosha的表達(dá)失調(diào), 從而影響了miRNA水平。而Srikantan等[41]更進(jìn)一步提出, 這兩個主要酶Dicer和Drosha不僅影響miRNA的合成水平, 同時也能影響生物整體的翻譯過程, Dicer水平的下降可以顯著增強(qiáng)細(xì)胞的衰老, 但是Drosha的下降卻對衰老沒有影響。這一發(fā)現(xiàn)提示, 在翻譯過程中Drosha/Dicer效應(yīng)可能是引起衰老的獨(dú)立因素,并進(jìn)一步證明了miRNA可以直接或間接地增強(qiáng)mRNA的翻譯[41]。

Das等[42]則發(fā)現(xiàn)人類多核苷酸磷酸化酶[human polynucleotide hosphorylase, hPNPase（old- 35）]是一種進(jìn)化保守的RNA加工酶, 能夠在調(diào)節(jié)細(xì)胞生理作用中起放大作用。hPNPase可能正是通過特定的mRNA或小分子非編碼的miRNA對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。因此, 有針對性地對hPNPase的過度表達(dá)進(jìn)行調(diào)控, 可以選擇性下調(diào)RNA的表達(dá), 從而參與整個病理生理過程。

諸如此類的報道尚不多見, 而且僅僅局限于少數(shù)的幾個器官細(xì)胞中, 是否在所有的衰老臟器中均存在這樣的酶合成異常, 值得我們進(jìn)行下一步的探討。

綜上所述, 我們對 miRNA的研究正在逐步走向更深的層次, 我們已經(jīng)認(rèn)識到, 一個miRNA可以調(diào)控多個下游靶標(biāo), 而這些標(biāo)靶蛋白中有不少都參與了細(xì)胞周期的調(diào)控, 從而在整個衰老體系中發(fā)揮或多或少的作用。但是, 限于整個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性、我們對于整個網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)成始終是處于初窺門徑、略知一二的狀態(tài), 但這同樣也給了我們廣闊的空間可以繼續(xù)研究。不可否認(rèn), 這些非編碼的小分子RNA在人類的生命旅程中扮演著相當(dāng)重要的角色,我們?nèi)绻軐?miRNA與細(xì)胞發(fā)育生長調(diào)控機(jī)制之間的聯(lián)系闡述得更加具體, 不僅僅局限于某幾個臟器或腫瘤細(xì)胞, 可以在整個機(jī)體的任何一個臟器,甚至于動物模型中將這些機(jī)制復(fù)制出來, 那么我們才算真正地對miRNA的機(jī)制了然于胸, 豁然貫通。只有搞明白了這些錯綜復(fù)雜的關(guān)系, 我們才有機(jī)會可以調(diào)控細(xì)胞生命過程中的多個分子, 到那時, 人類長生不老的美夢才會有可能實(shí)現(xiàn)。

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