流動引物PCR高效篩選陽性XRCC1基因敲除小鼠細胞的方法

茅衛(wèi)鋒，臧師竹，楊文波

(大連醫(yī)科大學 生物技術(shù)系，遼寧 大連 116044)

對陽性基因敲除細胞的篩選是順利完成基因敲除的重要步驟?，F(xiàn)在普遍使用PCR方法進行快速篩選，一個引物位于篩選標記中，一個引物位于同源臂外面，根據(jù)有無PCR產(chǎn)物鑒定陽性基因敲除細胞，這種篩選方法的缺點是沒有陽性對照，從而導致篩選效率低下。本研究將野生型基因敲除位點內(nèi)的20 bp DNA序列人工合成，加到基因敲除質(zhì)粒嘌呤霉素抗性基因5’端，并設(shè)計與之配對的流動引物。流動引物為PCR下游引物，利用來自同源臂外DNA序列設(shè)計PCR上游引物，使用這對引物PCR擴增，野生型和基因敲除陽性細胞克隆都能夠得到PCR產(chǎn)物。正常雙倍體細胞只有一個PCR產(chǎn)物，而細胞一個等位基因被敲除后，細胞含有一個野生型等位基因和一個敲除的基因座位，利用流動引物，可以得到兩個PCR產(chǎn)物，一個為野生型較大PCR產(chǎn)物，一個是敲除后較小的PCR產(chǎn)物。流動引物PCR篩選克服普通篩選過程中沒有陽性對照的缺點，可以提高篩選陽性基因敲除細胞的效率。利用流動引物，作者成功在小鼠體細胞CH12中篩選到XRCC1一個等位基因敲除的陽性克隆子。報告如下。

1 材料和方法

1.1 構(gòu)建含有流動引物的XRCC1基因敲除質(zhì)粒

引物WM11 5’ GTACC CTTTGACCCTCACTGCCAAT 3’和WM12 5’ AATTC ATTGGCAGTGAGGGTCAAAG 3’退火形成雙鏈DNA linker。KpnI和EcoRI酶切XRCC1基因敲除質(zhì)粒pWM3，將linker在DNA T4 連接酶 (Promega，USA)作用下連接到雙酶切的pWM3中，得到含有l(wèi)inker的基因敲除質(zhì)粒pWM4 (圖 1)。WM11為流動引物，設(shè)計篩選陽性基因敲除克隆子的上游PCR引物WM5 5’ GTCCTCAGGAGGGAAGGCTA 3’。

圖1 流動引物PCR篩選示意圖Fig 1 Diagram of floating primer PCR screening

1.2 XRCC1基因敲除質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到小鼠體細胞CH12中

使用Amaxa哺乳動物電轉(zhuǎn)化系統(tǒng) (Amaxa，USA)將基因敲除質(zhì)粒pWM4轉(zhuǎn)入小鼠體細胞系CH12中。嘌呤霉素(Puromycin)篩選嘌呤霉素抗性細胞克隆。提取細胞總DNA。

1.3 使用流動引物篩選陽性基因敲除克隆子

使用流動引物WM11和上游引物WM5，PCR篩選陽性克隆子 (圖1)。PCR程序 94 ℃ 3 min；30個循環(huán)，每個循環(huán)中94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃延伸3.5 min；72 ℃ 5 min。

2 結(jié) 果

2.1 陽性基因敲除細胞的篩選

使用流動引物和PCR上游引物，正?；蛐图毎@示一個3.0 kb PCR產(chǎn)物(圖2)，1個等位基因被敲除細胞顯示兩個PCR產(chǎn)物，3.0 kb的PCR產(chǎn)物是XRCC1正?；蛐?，2.5 kb 的PCR產(chǎn)物是XRCC1外顯子被敲除后的基因型(圖2)。

圖2 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig 2 The electrophoregram of PCR products

正常野生型XRCC1基因只有一個PCR產(chǎn)物。紅色星號為陽性基因敲除克?。? kb PCR產(chǎn)物為野生型基因型，2.5 kb PCR產(chǎn)物為基因敲除基因型。

Normal wild type XRCC1 gene generates one PCR product. The red asterisks are the positive gene knock out clones：3 kb PCR products show the wild type genotype. 2.5 kb PCR product show the gene knock out genotype.

2.2 PCR篩選基因敲除細胞的效率

本研究挑取100個嘌呤霉素抗性單克隆細胞分析基因敲除效率，PCR篩選結(jié)果顯示有3個單克隆細胞為單個等位基因敲除的陽性細胞克隆 (表 1)，顯示敲除單個等位基因陽性率為3%。

表1 使用流動引物篩選XRCC1基因敲除細胞效率Tab 1 The efficiency of utilizing floating primer to screen XRCC1 gene knock out cells

3 討 論

基因敲除技術(shù)做為一種強有力的研究基因功能的工具，已經(jīng)應用于生命科學和醫(yī)學幾乎所有的研究領(lǐng)域[1-3]。 通過基因敲除技術(shù)研制的人類疾病小鼠模型已經(jīng)超過500種[4-6]。本研究嘗試在小鼠體細胞CH12中敲除XRCC1的一個等位基因，并探索使用流動引物高效篩選陽性克隆。多種因素影響體細胞基因敲除的效率，首先基因敲除細胞系的選擇非常重要，通常選擇具有穩(wěn)定染色體組的二倍體細胞進行敲除，設(shè)計打靶載體分別敲除位于兩個染色體上的一對等位基因。在選擇要進行基因敲除的細胞系時，要盡量選擇遺傳背景清楚，最好已經(jīng)有成功例子的細胞系。對陽性基因敲除細胞的篩選，現(xiàn)在通常都會先使用PCR方法做第1輪的篩選， PCR結(jié)果呈陽性的細胞用Southern Blot確認。

本實驗報道利用流動引物的方法增加PCR篩選的效率。常規(guī)PCR篩選時，設(shè)計一個引物位于篩選標記中，一個引物位于同源臂外面，根據(jù)有無PCR產(chǎn)物鑒定陽性基因敲除細胞。基因打靶的同源短臂>2 kb，PCR橫跨過同源臂，所以PCR產(chǎn)物一般都接近3 kb, 這種長度PCR失敗的可能性比較高，而篩選沒有任何陽性對照，只是根據(jù)有沒有PCR結(jié)果判斷基因敲除是否成功，導致篩選的效率低下，經(jīng)常會因為PCR本身的原因漏檢了陽性基因敲除細胞。本實驗將野生型基因敲除位點內(nèi)的20 bp DNA序列人工合成，加到基因敲除質(zhì)粒嘌呤霉素抗性基因5’端，并設(shè)計與之配對的流動引物。使用流動引物PCR擴增，野生型和基因敲除陽性細胞克隆都能夠得到PCR產(chǎn)物。正常雙倍體細胞只有一個PCR產(chǎn)物，而細胞一個等位基因被敲除后，利用流動引物，可以得到兩個PCR產(chǎn)物，一個為野生型較大PCR產(chǎn)物，一個是敲除后較小的PCR產(chǎn)物。 使用流動引物PCR篩選可以克服普通篩選過程中沒有陽性對照的缺點，作者使用流動引物PCR篩選XRCC1基因敲除細胞克隆，篩選陽性克隆效率為3%。 本實驗結(jié)果顯示流動引物可以顯著增加陽性基因敲除細胞的篩選效率。

[1]Austin CP, Battey JF, Bradley A, et al. The knockout mouse project[J]. Nat Genet，2004，36: 921-924.

[2]Bunz F. Human cell knockouts[J]. Curr Opin Oncol, 2002, 14: 73-78.

[3]Copeland NG, Jenkins NA, Court DL. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics[J]. Nat Rev Genet, 2001, 2: 769-779.

[4]Wilhelm MT, Rufini A, Wetzel MK, et al. Isoform-specific p73 knockout mice reveal a novel role for DNp73 in the DNA damage response pathway[J]. Gene Dev, 2010, 24: 549-560.

[5]Rago C, Vogelstein B, Bunz F. Genetic knockouts and knockins in human somatic cells [J]. Nat Protoc, 2007, 2: 2734-2746.

[6]Hussaini SA, Kempadoo KA, Thault SJ, et al. Increased size and stability of CA1 and CA3 place fields in HCN1 knockout mice[J]. Neuron, 2011, 72: 643-653.