線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤研究中的進(jìn)展

凌孫彬，唐 博，王立明

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 七年制2007級(jí)，遼寧 大連 116044；2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 普外三科，遼寧 大連 116027)

近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展為腫瘤研究提供了全新的方法和思路，細(xì)胞水平的腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)研究得到了廣泛的開展，但是，現(xiàn)有分離技術(shù)下往往難以一步到位地獲得細(xì)胞的全蛋白質(zhì)組，大量的低豐度蛋白質(zhì)未能得到顯現(xiàn)和分析。因此，亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的開展可以作為傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)的重要補(bǔ)充，同時(shí)也極大地降低了針對(duì)全細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究的復(fù)雜性。線粒體(mitochondria，Mt)是真核細(xì)胞中一種重要的細(xì)胞器，除作為能量產(chǎn)生的場(chǎng)所外，已發(fā)現(xiàn)其參與包括腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展在內(nèi)的多種病理生理過程[1]。線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)已被運(yùn)用于部分腫瘤的研究中，進(jìn)一步闡明線粒體蛋白質(zhì)與腫瘤的關(guān)系，有助于尋找新的腫瘤相關(guān)特異性蛋白。本文就線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤研究中的進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)概述

線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究主要集中在兩方面：(1)線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)譜的建立；(2)運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法尋找疾病組和對(duì)照組的差異表達(dá)蛋白，研究蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化、翻譯后修飾以及細(xì)胞內(nèi)定位改變等。線粒體蛋白質(zhì)組研究常用技術(shù)包括：(1)用于蛋白質(zhì)分離純化的雙向凝膠電泳(2DE)、二維液相色譜(2D-LC)以及常用于亞細(xì)胞分離的差速離心和密度梯度離心技術(shù)；(2)蛋白質(zhì)鑒定技術(shù):質(zhì)譜技術(shù)(MS)、凝膠圖像分析、蛋白質(zhì)測(cè)序及氨基酸組成分析等；(3)用于蛋白質(zhì)相互作用及作用方式研究的酵母雙雜交系統(tǒng)、親和層析和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)等；(4)生物信息學(xué)。

目前，對(duì)復(fù)雜蛋白質(zhì)的分析一般有兩條技術(shù)路線：經(jīng)典的雙向凝膠電泳-質(zhì)譜技術(shù)(2-DE-MS)和二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(2D LC-MS/MS)。2-DE-MS可以反映蛋白質(zhì)分子的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、疏水性以及結(jié)合特性，而對(duì)低豐度、極端分子量、堿性、疏水性蛋白的分辨率低。線粒體是一個(gè)具有雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，內(nèi)膜和外膜上整合有很多膜蛋白質(zhì)，這些膜蛋白質(zhì)對(duì)于線粒體功能的發(fā)揮具有重要作用，但是膜蛋白質(zhì)具有很強(qiáng)的疏水性， 2DE-MS對(duì)線粒體蛋白的分離有局限性。2D LC-MS/MS可以彌補(bǔ)經(jīng)典策略的不足，不受蛋白質(zhì)等電點(diǎn)、分子量、疏水性的限制，且自動(dòng)化程度高。Pflieger等[2]應(yīng)用LC-MS/MS成功的鑒定出179種線粒體蛋白質(zhì)，其中43%是膜蛋白質(zhì)而且23%具有跨膜結(jié)構(gòu)域。2D LC-MS/MS主要的不足在于提供的關(guān)于完整蛋白質(zhì)的分子信息非常有限，尤其是有關(guān)翻譯后修飾的信息量較少。目前對(duì)線粒體分離純化的技術(shù)主要為差速離心結(jié)合密度梯度離心，該技術(shù)可以減少樣品污染，同時(shí)較好地保護(hù)線粒體不受破壞[3-4]。此外，本實(shí)驗(yàn)室采用以磁性納米粒子為介質(zhì)的線粒體分離技術(shù)，得到了更高的分離率和純度。

2 線粒體與腫瘤的關(guān)系

線粒體(mitochondria，Mt)是細(xì)胞中進(jìn)行生物氧化和能量轉(zhuǎn)換的細(xì)胞器，含有1000～2000種蛋白質(zhì), 約占整個(gè)細(xì)胞蛋白質(zhì)種類的5%～10%，在這些蛋白質(zhì)中，有2%是線粒體自己合成的，98%是由細(xì)胞核編碼、細(xì)胞質(zhì)核糖體合成后運(yùn)往線粒體的，因此，線粒體是一種半自主性的細(xì)胞器。線粒體不僅維持細(xì)胞的正常生理功能，還在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、自由基生成、細(xì)胞內(nèi)離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡的調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。線粒體有自己的遺傳系統(tǒng)和蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)，人線粒體DNA(mtDNA)是一個(gè)16 569 bp的雙鏈環(huán)狀閉合分子，編碼13種蛋白質(zhì)，22種tRNA和2種rRNA。D環(huán)(D-loop)是mtDNA主要的非編碼區(qū)，包含了線粒體基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列，其中央保守區(qū)呈現(xiàn)高度保守性[5]。mtDNA突變和線粒體本身功能的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[6]。mtDNA易受損傷，突變率遠(yuǎn)高于nDNA。mtDNA突變常發(fā)生于D-loop區(qū)，D-loop區(qū)控制著mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，可引起mtDNA拷貝數(shù)的改變和某些基因的異常表達(dá)[7]。早在1956年，Warburg[8]提出線粒體呼吸鏈的缺陷可以導(dǎo)致細(xì)胞去分化，并因此促進(jìn)細(xì)胞癌變，而最近認(rèn)為mtDNA的突變可以引起線粒體呼吸鏈的異常，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[9-10]。線粒體還參與細(xì)胞凋亡過程，其功能的異常能使腫瘤細(xì)胞獲得較強(qiáng)的抗凋亡能力[11-12]，一些特異性定位于線粒體的腫瘤相關(guān)因子，也被發(fā)現(xiàn)參與對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的控制[13-14]。

3 線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤研究中的進(jìn)展

3.1 線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)用于腫瘤差異蛋白的篩選

目前，仍有大量的線粒體蛋白未被鑒定，基于線粒體與腫瘤的相關(guān)性，線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤研究中顯示出重要意義。Hermann等[15]采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)定量分析了線粒體和核分別編碼的細(xì)胞色素C氧化酶(COX)亞單位間的比率，發(fā)現(xiàn)該比率與前列腺組織惡性進(jìn)程相關(guān)。該研究說明了核編碼線粒體蛋白質(zhì)在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮了重要作用，同時(shí)也顯示出對(duì)完整線粒體蛋白質(zhì)組鑒定的重要意義。Kim等[16]采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS，發(fā)現(xiàn)了4種高表達(dá)線粒體蛋白質(zhì)：泛醇-細(xì)胞色素C還原酶(ubiquinol-cytochrome C reductase)、烯酰輔酶A水合酶-1短鏈(mitochondrial short-chain enoyl-coenzyme A hydratase-1)、HSP6、線粒體延伸因子T(mitochondria elongation factor T)，這些蛋白可能成為存在于腫瘤細(xì)胞線粒體上的生物標(biāo)記物。中國(guó)Li等[17]在對(duì)肝癌亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)組比較分析中，發(fā)現(xiàn)了14個(gè)差異表達(dá)的線粒體蛋白質(zhì)，包括參與細(xì)胞能量代謝的相關(guān)酶類、細(xì)胞骨架蛋白及蛋白質(zhì)代謝相關(guān)蛋白，說明線粒體參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個(gè)過程。最近，Chen等[18]在對(duì)3種惡性程度和侵襲潛能不同的乳腺癌細(xì)胞系的線粒體差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，發(fā)現(xiàn)了新的具有診斷意義的相關(guān)蛋白。

3.2 線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)用于腫瘤耐藥相關(guān)蛋白的篩選

腫瘤細(xì)胞的耐藥性與細(xì)胞內(nèi)凋亡機(jī)制的異常改變密切相關(guān)，而線粒體對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控可直接影響其耐藥性。Jiang等[19]比較了非霍奇金淋巴瘤(NHL)拉吉細(xì)胞(Raji cells)阿霉素(ADR)培養(yǎng)與正常培養(yǎng)細(xì)胞株之間線粒體蛋白的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)了ADR培養(yǎng)的細(xì)胞線粒體中熱休克蛋白70(HSP70)、抗增殖蛋白(prohibitin，PHB)和人腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體B6(ATP-binding cassette transporter isoform B6，ABCB6)的異常表達(dá)。HSP70可抑制細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，其高表達(dá)常提示腫瘤患者預(yù)后不良[20]； ABCB6定位于線粒體外膜，與細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸有關(guān)，它的異常表達(dá)可能影響細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，從而起到促腫瘤和腫瘤細(xì)胞多藥耐藥等作用，但具體機(jī)制仍不清楚[21]；PHB可能通過與Rb蛋白(retinoblastoma protein)作用，抑制轉(zhuǎn)錄因子E2F的活性，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[22]。但是，最近Dai等[23]采用差示凝膠電泳(DIGE)技術(shù)分離樣品，比較了鉑類化療藥敏感的卵巢癌細(xì)胞系SKOV3、A2780和鉑類化療藥不敏感的卵巢癌亞細(xì)胞系SKOV3/CDDP、SKOV3/CBP、A2780/CDDP、A2780/CBP之間線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異，發(fā)現(xiàn)在耐藥細(xì)胞系線粒體中有PHB表達(dá)的顯著下調(diào)，認(rèn)為卵巢癌細(xì)胞的耐藥性與線粒體中PHB的低表達(dá)有關(guān)。PHB被認(rèn)為定位于細(xì)胞核、線粒體內(nèi)膜等處，上述現(xiàn)象可能與PHB在不同細(xì)胞內(nèi)的定位差別以及不同的線粒體分離技術(shù)有關(guān)；同時(shí)，PHB的功能也存在爭(zhēng)議，以上研究至少可以說明亞細(xì)胞分離技術(shù)在研究細(xì)胞內(nèi)廣泛定位的蛋白時(shí)的重要作用。另外，Jiang等[24]還分析了耐放療NHL拉吉細(xì)胞株的線粒體蛋白質(zhì)組，鑒定出了23種差異表達(dá)蛋白，其中GAPDH、RECQL4、MKI67和ATAD3B可能作為腫瘤細(xì)胞耐受放療的潛在標(biāo)記物。

4 展 望

由于有兩套相對(duì)獨(dú)立的蛋白質(zhì)編碼系統(tǒng)的存在以及線粒體與細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能的密切相關(guān)性，線粒體基因和蛋白水平上的變化極易引起細(xì)胞功能的紊亂。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，細(xì)胞線粒體本身數(shù)量與功能的改變也會(huì)引起相關(guān)蛋白含量的變化。目前，線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究和應(yīng)用仍不廣泛，但是，既往的研究已經(jīng)體現(xiàn)出線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在腫瘤研究中的價(jià)值，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，尤其是亞細(xì)胞分離技術(shù)的進(jìn)步，線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)將成為腫瘤研究中新的熱點(diǎn)。

[1] Maximo V,Lima J,Soares P,et al.Mitochondria and cancer[J].Virchows Archiv,2009,454(5):481-495.

[2] Pflieger D,Le Caer JP,Lemaire C,et al.Systematic identification of mitochondrial proteins by LC-MS/MS[J]. Anal Chem,2002,74(10):2400-2406.

[3] Zhang J,Li X,Mueller M,et al.Systematic characterization of the murine mitochondrial proteome using functionally validated cardiac mitochondria[J].Proteomics,2008,8(8):1564-1575.

[4] Elena S,Assunta L,Daniela G,et al.Mammalian mitochondrial proteome and its functions:Current investigative techniques and future perspectives on ageing and diabetes[J].JIOMICS,2011,1(1):17-27.

[5] Kang D，Hamasaki N.Mitochondrial oxidative stress and mitochondrial DNA[J].Clin Chem Lab Med,2003,41(10):1281-1288.

[6] Modica-Napolitano JS,Kulawiec M,Singh KK.Mitochondria and human cancer[J].Curr Mol Med,2007,7(1):121-131.

[7] Lee HC,Li SH,Lin JC,et al.Somatic mutations in the D-loop and decrease in the copy number of mitochondrial DNA in human hepatocellular carcinoma[J].Mutat Res,2004,547(1-2): 71-78.

[8] Warburg O.On respiratory impairment in cancer cells[J].Science,1956,124(3215): 269-270.

[9] Habano W,Sugai T,Nakamura SI,et al.Microsatellite instability and mutation of mitochondrial and nuclear DNA in gastric carcinoma[J].Gastroenterology,2000,118(5):835-841.

[10] Gasparre G,Porcelli AM,Bonora E,et al.Disruptive mitochondrial DNA mutations in complex I subunits are markers of oncocytic phenotype in thyroid tumors[J].Pro Natl Acad Sci USA,2007,104(21):9001-9006.

[11] Baysal BE.Role of mitochondrial mutations in cancer[J].Endocr Pathol,2006,17(3):203-212.

[12] Shen L,Lan Z,Sun X,et al.Proteomic analysis of lanthanum citrate-induced apoptosis in human cervical carcinoma SiHa cells[J].Biometals,2010,23(6): 1179-1189.

[13] Sp?nkuch-Schmitt B,Bereiter-Hahn J,Kaufmann M,et al.Effect of RNA silencing of polo-like kinase-1 (PLK1) on apoptosis and spindle formation in human cancer cells[J].J Natl Cancer Inst,2002，94(24):1863-1877.

[14] Elhasid R,Sahar D，Merling A,et al.Mitochondrial pro-apoptotic ARTS protein is lost in the majority of acute lymphoblastic leukemia patients[J].Oncogene,2004,23(32): 5468-5475.

[15] Herrmann PC,Gillespie JW,Charboneau L,et al.Mitochondrial proteome:altered cytochrome c oxidase subunit levels in prostate cancer[J].Proteomics,2003,3(9):1801-1810.

[16] Kim HK,Park WS,Kang SH,et al.Mitochondrial alterations in human gastric carcinoma cell line[J].Am J Physiol Cell Physiol,2007,293(2):C761-C771.

[17] Li Xing,Pan Wei,Qiu Feng,et al.Comparative proteome analysis of hepatoma cells at subcellular level[J].JMCB,2006,39(5):399-406.

[18] Chen YW,Chou HC,Lyu PC,et al.Mitochondrial proteomics analysis of tumorigenic and metastatic breast cancer markers[J].Funct Integr Genomics,2011,11(2): 225-239.

[19] Jiang YJ,Sun Q,Fang XS,et al.Comparative mitochondrial proteomic analysis of Rji cells exposed to adriamycin[J].Mol Med,2009,15(5-6): 173-182.

[20] Ciocca DR and SK Calderwood.Heat shock proteins in cancer: diagnostic, prognostic, predictive, and treatment implications[J].Cell Stress Chaperones,2005,10(2):86-103.

[21] Szakács G,Annereau JP,Lababidi S,et al.Predicting drug sensitivity and resistance: profiling ABC transporter genes in cancer cells[J].Cancer Cell,2004,6(2): 129-137.

[22] Fusaro G,Wang S,Chellappan S.Differential regulation of Rb family proteins and prohibitin during camptothecin-induced apoptosis[J].Oncogene,2002,21(29):4539-4548.

[23] Dai Z,Yin J,He H,et al.Mitochondrial comparative proteomics of human ovarian cancer cells and their platinum-resistant sublines[J].Proteomics,2010,10(21):3789-3799.

[24] Jiang Y,Liu X,Fang X,et al.Proteomic analysis of mitochondria in Raji cells following exposure to radiation: implications for radiotherapy response[J].Protein Pept Lett, 2009, 16(11):1350-1359.