仔豬胃腸道優(yōu)良性狀乳酸桿菌的分離和鑒定

蔣建軍，肖紅冉，張杰，陳少秀，孫磊，孟小江，王鵬雁

（石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子，832003）

健康仔豬主要通過產(chǎn)道時獲得了母體的微生物，并在生長環(huán)境中進(jìn)一步接觸了各種微生物，經(jīng)過相互適應(yīng)和選擇，一些特定的微生物在仔豬胃腸道內(nèi)定植。新生仔豬出生24h胃腸內(nèi)已定植了乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌、大腸桿菌、消化球菌、擬桿菌和酵母菌等，8－22日形成以乳酸桿菌、雙歧桿菌、擬桿菌、大腸桿菌和消化球菌為優(yōu)勢菌的定型菌群［1－3］。這些菌群在動物體內(nèi)的存活能力的高低將直接影響其健康促進(jìn)作用的發(fā)揮，其中乳酸桿菌為體內(nèi)優(yōu)勢菌群，對動物體具有廣泛的有益生理功能［4－6］。因此，其可部分替代抗生素的功效，有效降低藥物殘留和減少藥物的耐藥性。目前益生菌的安全狀況越來越受到公眾的關(guān)注，因此對益生菌的正確鑒定是保證其產(chǎn)品食用安全性的重要基礎(chǔ)。

本實(shí)驗利用乳酸菌選擇培養(yǎng)基從健康仔豬胃腸道分離鑒定并篩選出優(yōu)良性狀的有益乳酸菌，以期為乳酸菌的進(jìn)一步正確利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

Rogosa SL完全選擇性培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基（購自Sigma公司，根據(jù)說明書制備液體和固體的培養(yǎng)基，用于乳酸桿菌的選擇培養(yǎng)和分離后細(xì)菌的培養(yǎng)）。API 50CHL V5．0試劑盒購自梅里埃（中國）有限責(zé)任公司。豬源大腸桿菌、金黃色葡萄球菌為本實(shí)驗室保存。

1．2 方法

1．2．1 實(shí)驗動物和樣品采集

從石河子某豬場選取30日齡健康長白豬2頭。處死后立即無菌采集十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸部位，剪取5cm2胃腸粘膜，用無菌生理鹽水沖洗至無肉眼可見的食糜后，將胃腸粘膜浸入10mL PBS（pH 7．4）液中，用鑷子夾住劇烈搖動5min。靜置2～3min，上清液用于乳酸桿菌的分離。

1．2．2 菌種的分離

用移液槍分別吸取50μL胃腸粘膜處理后的上清液接在Rogosa SL完全選擇性培養(yǎng)基上，用L棒將上清抺勻。將培養(yǎng)基置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。挑取培養(yǎng)基上的單個針尖大小的菌落，接于MRS培養(yǎng)基上置于37℃的10%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行厭氧培養(yǎng)24h觀察生長情況。挑取培養(yǎng)基上的單個菌落在接于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，觀察液體培養(yǎng)基是否變渾濁，有渾濁的放置4℃ 冰箱貯藏備用。

1．2．3 乳酸桿菌的初步鑒定

1．2．3．1 革蘭氏染色 挑選出 MRS劃線平板上以及Rogosa SL平板上的單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色。鏡下觀察分離菌形態(tài)。菌體呈紅色的為陰性，紫色的為陽性，選擇革蘭氏陽性菌、染色濃度深淺不均勻、形態(tài)不一的桿菌，進(jìn)一步做接觸酶試驗。

1．2．3．2 接觸酶實(shí)驗 挑取Rogosa SL培養(yǎng)基在厭氧條件下培養(yǎng)的單個菌落，滴加3%H2O2混勻，如果沒有氣泡冒出說明是陰性，如有氣泡說明是陽性。

1．2．4 菌種的種屬鑒定

運(yùn)用API鑒定系統(tǒng)以API 50CHL V5．0試劑盒對分離的乳酸桿菌進(jìn)行鑒定。所有操作按照說明書中的操作方法進(jìn)行。

1．3 優(yōu)良性狀乳酸菌的篩選

1．3．1 小鼠安全性實(shí)驗

取體重15～20g的小白鼠12只，隨機(jī)分成4組，每組3只，其中1、2、3組為試驗組，口服乳酸菌菌液0．5mL，其濃度為6．0×109CFU／mL；第4組為對照組，口服生理鹽水0．5mL。連續(xù)觀察7d小白鼠的健康狀況，并于7d后剖檢小鼠，觀察其內(nèi)臟器官與對照組有無差異。

1．3．2 生長曲線的繪制

將分離鑒定的菌種加入全波段酶標(biāo)儀中，每種菌做3個平行，于37℃、8%CO2溫箱中培養(yǎng)，每隔0．5h測出OD600值，記錄數(shù)據(jù)，描繪出乳酸桿菌的生長曲線。

1．3．3 耐酸實(shí)驗

設(shè)4個不同pH處理組（pH值分別為1．5、2．5、3．5、4．5），分別用1mol／L HCl調(diào)節(jié) MRS液體培養(yǎng)基至上述pH值。將生長速度較快的菌活化，以5%（V／V）的接種量分別接種上述各處理的 MRS液體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)。

在接種初始及接種后30、60、90、120、150min取上述各處理組菌液，接種到MRS平板上37℃培養(yǎng)24h后觀察菌落生長個數(shù)。

1．3．4 膽鹽耐受實(shí)驗

實(shí)驗設(shè)4個膽鹽處理組，MRS培養(yǎng)基中分別加0．1%、0．2%、0．3%、0．4%的豬膽鹽。取1mL 培養(yǎng)液1．0×109CFU／mL接種于9mL高膽鹽濃度MRS液37℃培養(yǎng)稀釋相應(yīng)的倍數(shù)，在培養(yǎng)接種后1、2、3、4h取上述對照及各處理中培養(yǎng)菌液，取0．1 mL涂MRS板接種到MRS平板上37℃下培養(yǎng)24 h后觀察菌落個數(shù)。

若生長數(shù)目超過30個（3．0×106CFU／mL）則表明其生長良好能夠耐該濃度的膽鹽；若生長數(shù)目在5～30個則表明其生長較差，耐受該濃度膽鹽較差；若生長數(shù)目小于5個則表明其不生長，不能耐受該膽鹽濃度。

1．3．5 體外抑菌實(shí)驗

取90mm的平皿，注入滅菌的營養(yǎng)瓊脂，凝固后取37℃，24h培養(yǎng)的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌液適量涂布于平板之上，靜置30min，使菌液充分吸收。取滅菌的玻璃管在平板上打孔，以少量滅菌營養(yǎng)瓊脂封底，分別在孔中加入制備好的乳酸菌代謝產(chǎn)物及活菌體。同時設(shè)MRS培養(yǎng)液做對照。將加完樣的平皿小心放入37℃恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24h后取出測量抑菌圈大小，計算其平均值。

2 結(jié)果與分析

2．1 乳酸桿菌的分離和初步鑒定

應(yīng)用Rogosa SL完全選擇性培養(yǎng)基分離的菌落呈圓形、表面隆起、邊緣整齊的灰白色或乳白色，表面濕潤光滑。顯微鏡下為革蘭氏陽性中等大小桿菌或短桿菌，散在或柵欄狀成堆排列（圖1）。

經(jīng)初步篩選從仔豬胃腸道分離鑒定出60株乳酸桿菌。其中，來源于胃部16株，空腸8株，十二指腸4株，結(jié)腸22株。

圖1 分離菌形態(tài)學(xué)觀察Fig．1Morphology observation of isolated bacteria

2．2 API生化鑒定

經(jīng)API鑒定了16株乳酸菌，其中9株是嗜酸乳桿菌，5株是發(fā)酵乳桿菌，2株是唾液乳桿菌，鑒定結(jié)果見表1。

2．3 小鼠安全性實(shí)驗

經(jīng)過1周的飼喂，對照組和試驗組的小白鼠生長狀況健康良好，食欲正常，未出現(xiàn)發(fā)病和死亡，剖檢臟器未見異常，表明各分離菌株經(jīng)口服對小白鼠無毒副作用，菌株安全性能良好。

表1 API系統(tǒng)鑒定結(jié)果Tab．1Results of API identification

2．4 乳酸菌生長曲線的繪制

用全波段酶標(biāo)儀對分離鑒定的13株乳酸桿菌進(jìn)行OD600值的測定，分別畫出8株嗜酸乳桿菌和5株發(fā)酵乳酸桿菌的生長曲線（圖2、3）。

13株菌的生長曲線（圖2）表明，8株嗜酸乳桿菌和4株發(fā)酵乳桿菌生長狀況均良好。從中選擇變化大、生長時間較長的L4號菌、L8號菌和L10號菌種，作為微生物添加劑的候選菌株做進(jìn)一步研究。其中L14號菌生長緩慢不適宜作為微生物添加劑。

圖2 8株嗜酸乳桿菌的生長曲線Fig．2Growth curve of 8strains Lactobacillus acidophilus

圖3 5株發(fā)酵乳桿菌的生長曲線Fig．3Growth curve of 5strains Lactobacillus fermenti

2．5 耐酸實(shí)驗

本實(shí)驗設(shè)置了4個處理組，觀察并比較各個處理組的活菌個數(shù)，結(jié)果顯示，pH在1．5時，L7（嗜酸乳桿菌）和L14（發(fā)酵乳桿菌）對酸的耐受能力最強(qiáng)。pH 2．5時，各個平板不同時間段菌落個數(shù)均大于50個，并且隨著時間的增加，活菌個數(shù)也相應(yīng)的增加。

2．6 膽鹽耐受實(shí)驗

本實(shí)驗設(shè)0．1%、0．2%、0．3%、0．4%四個不同的膽鹽濃度，觀察各時間點(diǎn)（1h、2h、3h、4h）的生長情況及活菌數(shù)，結(jié)果顯示，L7（嗜酸乳桿菌）、L3（嗜酸乳桿菌）、L14（發(fā)酵乳桿菌）對0．2%的膽鹽濃度耐受性比較強(qiáng)，而只有L14（發(fā)酵乳桿菌）對0．3%濃度的鹽仍有較好的耐受能力。

2．7 體外抑菌試驗

經(jīng)測量，L7（嗜酸乳桿菌）和L14（發(fā)酵乳桿菌）的代謝產(chǎn)物對葡萄球菌、大腸桿菌有明顯的抑菌作用，其中對葡萄球菌的作用出現(xiàn)的晚而弱，而未接種的MRS液對致病菌無抑菌現(xiàn)象。

3 討論

1）本試驗選擇斷奶后健康的仔豬胃腸道不同部位的粘膜，是由于乳酸桿菌對動物種屬、年齡、消化道部位的粘附力及生長繁殖等均具有很強(qiáng)的特異性［7］。選擇從粘膜分離而不是從食糜分離，是由于自食糜分離的乳酸桿菌很可能是從飼料中帶入，也可能是粘膜上脫落下來的不適應(yīng)生存的細(xì)菌。而從粘膜分離到的乳酸桿菌本質(zhì)上可以在胃腸道定殖。這些菌是與宿主長期自然選擇相互適應(yīng)的結(jié)果，所具有的生物特性是其本質(zhì)屬性，不易發(fā)生改變。

2）本實(shí)驗中從不同部位提取的8株嗜酸乳桿菌、5株發(fā)酵乳桿菌及唾液乳桿菌的生長情況均不同。這是由于胃腸環(huán)境的不同導(dǎo)致菌種的個體差異還是存在亞種或是變異株，還需要進(jìn)一步研究。耐酸實(shí)驗與膽鹽耐受實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)這些菌都既耐酸又耐膽鹽。

3）乳酸桿菌的保存與復(fù)活是制約本實(shí)驗進(jìn)程的一個關(guān)鍵因素，所以本研究參照了文獻(xiàn)［8］中的保存方法。實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)多株乳酸桿菌在MRS斜面的保存在1周內(nèi)死亡，而當(dāng)使用MRS甘油冷凍保存后，則至少保存8個月以上。

4）本實(shí)驗應(yīng)用API系統(tǒng)對乳酸桿菌進(jìn)行了快速鑒定，為健康仔豬菌群分布提供了有益的數(shù)據(jù)。所分離的乳酸桿菌菌株主要為嗜酸乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌，在鑒定的菌株中，其中50%菌株來源于胃，其他菌株來源于各個腸道。在分離鑒定過程中，由于在結(jié)腸和胃上分離到大量的菌株，而在空腸、十二指腸上分離到的較少，所以在鑒定時選取的菌株在胃和結(jié)腸上較多。同時，由于胃黏膜上分離出的菌株形態(tài)較多，而結(jié)腸黏膜上分離出的菌形態(tài)單一，所以在鑒定菌株時胃粘膜上鑒定的細(xì)菌較多，而結(jié)腸其次。另外，據(jù)實(shí)驗結(jié)果可以看出豬胃中分離到的乳酸桿菌可能對胃的粘附力較好，而對腸道粘膜的粘附力較差［9］。

乳酸桿菌制劑治療由于菌群失調(diào)引起的各種下痢，均有明顯的防治效果［10］，在研制乳酸菌制劑時菌株的選擇必須根據(jù)在豬體內(nèi)酸桿菌的適應(yīng)性來篩選乳酸桿菌的制劑添加，如何使用也要根據(jù)豬體內(nèi)乳酸桿菌的變化情況而定。因此，本研究為此提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

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