δ-睡眠肽與GFP融合蛋白的表達(dá)和純化

崔小進(jìn)，楊帆，戴有金，李章富，呂永通，胡風(fēng)慶

(遼寧大學(xué)生命科學(xué)院生物材料與生物制藥實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽110036)

Delta-睡眠肽(Delta sleep inducing peptide，DSIP)是一種存在于動物體內(nèi)的促睡眠物質(zhì)，由Monnier等［1］于1963年從被微電流刺激的家兔腦靜脈血通過體外血液透析等方法分離得到。Delta-睡眠肽為Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu 9個氨基酸所構(gòu)成，是分子量為848.98 u的九肽［2］。將其注射到動物靜脈，可以增強(qiáng)慢波睡眠時(shí)相的Delta-波及睡眠梭形活動，即有促進(jìn)睡眠的作用，故稱為Delta-睡眠肽。DSIP作用于睡眠的途徑并未得到透徹的研究，一些研究顯示DSIP是通過影響腦中血清素(serotonin)和γ-氨基酪酸(GABA)的釋放來產(chǎn)生促睡眠作用的［3］。研究還顯示內(nèi)源性的DSIP參與了許多肽類激素的調(diào)控:它可以抑制促甲狀腺激素、促生長素抑制素的分泌，刺激促黃體激素、生長激素、促生長激素釋放激素的分泌［4-5］，此后隨著研究的深入，DSIP還被發(fā)現(xiàn)具有多種生理功能，因此被視為一種多功能的神經(jīng)調(diào)節(jié)肽，這些功能中最顯著的生理活性就是其應(yīng)激保護(hù)作用。DSIP作為一種應(yīng)激限制因子(stresslimiting factor)可以降低環(huán)境中緊張因素對機(jī)體的損害，人體中內(nèi)源性DSIP水平在35歲后會有升高來減少應(yīng)激反應(yīng)對機(jī)體的損害［6］。在免疫應(yīng)答中，DSIP還可以起到免疫調(diào)節(jié)劑的作用，并能促進(jìn)細(xì)胞分化兼具有抗腫瘤的作用［7］。DSIP具有降低體溫的特性［8］;DSIP還具有舒張血管的活性，高血壓的人或老鼠接受DSIP后，血壓會下降;DSIP具有調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的作用;DSIP還可以通過增強(qiáng)腦啡肽與鴉片受體的作用而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用;DSIP具有抗酒精和抗鴉片活性，可抑制對于酒精和鴉片的依賴;另外DSIP還具有抗驚厥的作用。由于Delta-睡眠肽在體內(nèi)的含量極少，分離純化起來，不但繁瑣且非常困難，加之又有了對Delta-睡眠肽一級結(jié)構(gòu)的了解，人們開始試圖通過化學(xué)合成的方法來獲得Delta-睡眠肽，并且取得了一定的成功。早在1979年，就報(bào)道了Delta-睡眠肽及其類似物的合成工作［9］。此后，對其合成、生物活性及構(gòu)效關(guān)系的研究均取得進(jìn)一步發(fā)展，為其臨床應(yīng)用提供了進(jìn)一步的依據(jù)。本研究對DSIP基因進(jìn)行克隆，構(gòu)建載體pET-28a-DSIP，但由于目的編碼區(qū)過短，DSIP無法實(shí)現(xiàn)表達(dá)。在質(zhì)粒pET-28a-DSIP中插入一段編碼含有265個氨基酸殘基的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因，通過融合表達(dá)的方法成功實(shí)現(xiàn)了DSIP的表達(dá)，并純化得到GFP-DSIP融合蛋白，為進(jìn)一步研究DSIP的生物學(xué)作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株原核表達(dá)載體pET-28a質(zhì)粒，購自Novagen公司;pEGFP-C1表達(dá)載體以及E.coli BL21(DE3)菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，DNA Marker，均購自TaKaRa公司;小量質(zhì)粒提取試劑盒，Pfu高保真DNA聚合酶，RNA酶，DNA回收試劑盒，均購自上海生工生物工程公司;B型超純質(zhì)粒小樣快速提取試劑盒，購自寶信生物技術(shù)有限責(zé)任公司;親和層析介質(zhì)Ni-NTA His-Bind Resin，購自Qiaqing公司;其他試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 SOE PCR擴(kuò)增DSIP基因序列根據(jù)DSIP基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引入編碼腸激酶識別位點(diǎn)的堿基序列和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)DSIP1:5'-TCCGAATTCGACGACGACGACAAATGGGCTGGTGGTGACGC-3'。下游引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)DSIP2:5'-GTGCTCGAGATTATTCACCGGAAGCGTCACC-ACCAGCCCA-3'。利用上述引物進(jìn)行SOE-PCR拼接延伸出整個DSIP基因及腸激酶識別位點(diǎn)序列。反應(yīng)條件為95℃5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后，用膠回收試劑盒純化并回收。

1.2.2 表達(dá)載體pET-28a-DSIP的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ對純化的DSIP目的片段和pET-28a質(zhì)粒在37℃雙酶切過夜，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后分別純化回收。在16℃，T4連接酶作用下，將DSIP片段和pET-28a過夜連接，然后轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，測序鑒定。

1.2.3 綠色熒光蛋白基因的PCR擴(kuò)增根據(jù)GFP基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引入NdeⅠ酶切位點(diǎn)GFP1:5'-GTACATATGATGGTG AGCAAGGGCGAG-3'。下游引入酶切位點(diǎn)BamHⅠGFP2:5'-ATTGAATTCTCTAGATCCGG TGGAGCCC-3'，以質(zhì)粒pEGFP-C1為模板，通過PCR擴(kuò)增GFP。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，58℃退火60 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)，最后72℃充分延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后，用膠回收試劑盒純化并回收。

1.2.4 表達(dá)載體pET28a-GFP-DSIP的構(gòu)建GFP基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切后插入到載體pET-28a-DSIP，然后轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，挑取陽性克隆雙酶切鑒定，測序鑒定。

1.2.5 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)將測序鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21表達(dá)菌種中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。菌液經(jīng)37℃振揺培養(yǎng)過夜后以1∶100比例接種到新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600值約為0.6時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，30℃繼續(xù)振搖培養(yǎng)4 h，收菌進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳(SDSPAGE)鑒定誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物。

1.2.6 融合蛋白的純化取過夜培養(yǎng)菌液10 mL，接入200 mL含Kan(40 μg/mL)的LB培養(yǎng)基，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6后IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，培養(yǎng)結(jié)束后離心收集菌體;將菌體重懸于4 mL結(jié)合緩沖液中，加入溶菌酶至1 mg/mL，超聲破碎菌體后離心去除不溶性細(xì)胞碎片。收集上清參照鎳親和層析柱使用說明過鎳親和層析柱純化融合蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET28a-GFP-DSIP的構(gòu)建

2.1.1 DSIP的SOE PCR擴(kuò)增結(jié)果根據(jù)設(shè)計(jì)的引物DSIP1和DSIP2，SOE PCR擴(kuò)增DSIP，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物大小為57 bp，預(yù)期結(jié)果基本一致，結(jié)果見圖1。

圖1 SOE PCR擴(kuò)增DSIP基因結(jié)果Fig.1 SOE PCR of DSIP

2.1.2 GFP的PCR擴(kuò)增結(jié)果根據(jù)設(shè)計(jì)的引物GFP1和GFP2，PCR擴(kuò)增GFP，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物大小為798 bp，預(yù)期結(jié)果基本一致，結(jié)果見圖2。

圖2 綠色熒光蛋白基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR of GFP

2.1.3 重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果用BamHⅠ和NdeⅠ酶切重組質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳分析得到789和5 360 bp左右2條條帶，與預(yù)期相符，該重組質(zhì)粒經(jīng)酶切電泳鑒定正確，結(jié)果見圖3。

圖3 pET28a-GFP-DSIP雙酶切驗(yàn)證結(jié)果Fig.3 Identification of pET28a-GFP-DSIP by digesting with restiction enzymes

對重組質(zhì)粒中插入的序列進(jìn)行測序鑒定，經(jīng)Blast序列分析軟件比對，結(jié)果表明，GFP以及DSIP基因正確插入到了pET-28a載體中，成功構(gòu)建了pET28a-GFP-DSIP重組載體。

2.2 重組GFP-DSIP融合蛋白的表達(dá)純化鑒定結(jié)果

表達(dá)質(zhì)粒pET28a-GFP-DSIP經(jīng)1 mmol/L IPTG于30℃誘導(dǎo)4 h，SDS-PAGE結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化表達(dá)質(zhì)粒株菌誘導(dǎo)后有1條明顯的融合蛋白表達(dá)條帶。從圖4中可以看出GFP-DSIP融合肽的分子量與預(yù)期大小(32 ku)相符。融合蛋白經(jīng)Ni-NTA親和層析柱分離純化后，在SDS-PAGE中顯示出預(yù)期大小的純化后的蛋白條帶(圖4)。

圖4 GFP-DSIP誘導(dǎo)表達(dá)及純化的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE of expression and purification of GFP-DSIP

3 討論

自從發(fā)現(xiàn)Delta-睡眠肽，一些驗(yàn)證DSIP是主要的內(nèi)源性睡眠因子的假說的研究便被開展起來，人們考慮用它來治療失眠［10］，很多研究已經(jīng)證實(shí)這一想法。Delta-睡眠肽已經(jīng)被描繪成一種睡眠促進(jìn)物質(zhì)而不是一種鎮(zhèn)靜劑。

應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法和基因工程手段，通過原核表達(dá)系統(tǒng)來獲得Delta-睡眠肽將為Delta-睡眠肽的內(nèi)源性和生物合成等一系列問題提供重要的信息，也可能會為Delta-睡眠肽的臨床應(yīng)用提供良好的發(fā)展契機(jī)，對促進(jìn)人們對于睡眠的認(rèn)識將有很大的意義，也將為患睡眠障礙的病人貢獻(xiàn)一個新致眠藥物提供了可能性。

本研究通過SOE-PCR方法擴(kuò)增到帶有腸激酶識別位點(diǎn)和DSIP九肽的編碼序列，經(jīng)酶切、連接構(gòu)建表達(dá)載體pET-28a-DSIP。以pEGFP-C1為模板擴(kuò)增出GFP的基因，插入pET-28a-DSIP中構(gòu)建表達(dá)載體pET-28a-GFP-DSIP，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得大量可溶性表達(dá)產(chǎn)物?？扇苄缘鞍捉?jīng)Ni-NTA親和層析柱純化，SDS-PAGE電泳分離，考馬斯亮藍(lán)染色分析，呈現(xiàn)一條帶，證明本研究成功構(gòu)建融合蛋白GFPDSIP，其純度達(dá)電泳純。

［1］ Monnier M，Koller T，Graber S.Humoral influences of induced sleep and arousal upon electrical brain activity of animals with crossed circulation［J］.Experimental Neurology，1963，8(3):264-277.

［2］ Schoenenberger GA，Monnier M.Charaterization of a delta-electroencephalogram(-sleep-)inducing peptide［J］.PNAS，1977，74(3):1282-1286.

［3］ Schoenenberger GA.Characterization，properties and multivariate functions of Delta-Sleep Inducing Peptide(DSIP)［J］.European Neurology，1984，23(5):321-345.

［4］ Iyer KS，McCann SM.Delta sleep inducing peptide(DSIP)stimulates the release of LH but not FSH via a hypothalamic site of action in the rat［J］.Brain Research Bulletin，1987，19(5):535-538.

［5］ Kovalzon VM.DSIP:a sleep peptide or unknown hypothalamic hormone?［J］.J Evol Biochem Physiol，1994，30(2):195-199.

［6］ Koplik EV，Umryukhin PE，Konorova IL，et al.Delta sleepinducing peptide and deltaran:potential approaches to antistress protection［J］.Neurosci Behav Physiol，2008，38(9):953-957.

［7］ Sukhikh GT，Meerson FZ，Mikhaleva II.Stress decrease in resistance of an organism to a tumor growth and its prevention by central inhibiting metabolites［J］.Dokl Akad Nauk USSR，1984，278(3)253-256.

［8］ Pollard BJ and Pomfrett CJD.Delta sleep-inducing peptide［J］.Eur J Anaesthesiol，2001，18(7):419-422.

［9］ Graf MV，Hunter CA，Kastin AJ.Presences of delta sleep inducing peptide like material in human milk［J］.ClinEndocrinol Metab，1984，59(1):127-132.

［10］ Khvatova EM，Samartzev VN，Zagoskin PP，et al.Delta sleep inducing peptide(DSIP):effect on respiration activity in rat brain mitochondria and stress protective potency under experimental hypoxia［J］.Peptides，2003，24(2):307-311.