60CO照射對(duì)豚鼠聽力及耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Caspase表達(dá)的影響*

謝利紅 唐安洲 尹時(shí)華 譚頌華 孫貝蒂 鐘華林

感音神經(jīng)性聾是頭頸部惡性腫瘤放射治療后的常見并發(fā)癥，影響患者的生存質(zhì)量[1，2]。放療導(dǎo)致感音神經(jīng)性聾的機(jī)理仍不清楚，有學(xué)者認(rèn)為，內(nèi)耳細(xì)胞凋亡可能是感音神經(jīng)性聾發(fā)生的細(xì)胞機(jī)理[3]。細(xì)胞凋亡的發(fā)生是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，其啟動(dòng)受到精確調(diào)控。Caspase8、Caspase9、Caspase3是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的類半胱氨酸蛋白酶的重要家族成員，是細(xì)胞凋亡的重要蛋白[4]。本實(shí)驗(yàn)觀察60CO照射后凋亡相關(guān)蛋白Caspase8、Caspase9、Caspase 3在耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的表達(dá)，旨在探討60COγ射線對(duì)豚鼠聽功能的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 白化豚鼠40只，體重250～350 g(普通級(jí))，購(gòu)自湖南開福區(qū)東創(chuàng)科技服務(wù)部，雌雄不拘。隨機(jī)分為放射組與對(duì)照組，對(duì)照組8只不實(shí)施60CO照射；放射組32只，以右耳為照射耳，于60CO照射后第1、4、7、14天行ABR檢查后，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各處死8只豚鼠，行耳蝸HE染色及免疫組織化學(xué)染色。

1.260CO照射方法 放射組豚鼠用1%戊巴比妥鈉(3.5 μl/g)麻醉固定后，用GWXJ80型60CO遠(yuǎn)距離治療機(jī)(中國(guó)核動(dòng)力研究設(shè)計(jì)院設(shè)備制造廠)對(duì)豚鼠右耳耳顳部行一次性60CO照射70 Gy，輻射深度2.0 cm，照射范圍為2 cm×2 cm，源皮距80 cm，自制鉛板遮蓋非照射部位。

1.3ABR反應(yīng)閾檢測(cè) 采用美國(guó)尼高力VikingQuest進(jìn)行測(cè)試，豚鼠麻醉后置于俯臥位，刺激聲選擇短聲，重復(fù)率11.4次/秒，平均疊加次數(shù)512次，掃描時(shí)間10 ms，濾波帶寬0.15～3.00 kHz。記錄電極位于豚鼠顱頂，參考電極位于耳垂，地極接鼻尖。把可引出波III的最低刺激強(qiáng)度確定為閾值。

1.4石蠟標(biāo)本制備與HE染色 斷頭經(jīng)腹側(cè)取豚鼠聽泡，暴露耳蝸并在蝸尖鉆孔，推鐙骨底板脫位，刺破圓窗膜，用4%多聚甲醛固定液灌流固定后，再放入固定液4 ℃固定24 h以上。用10%EDTA脫鈣10～14 d，酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，耳蝸中軸切片。石蠟切片脫蠟和水化，蘇木精染色10 min，1%鹽酸酒精分色，自來(lái)水藍(lán)化，0.5%伊紅染色1 min，酒精脫水，透明，封片。

1.5免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片脫蠟和水化，pH 6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液煮沸熱修復(fù)抗原10 min，3%H2O2室溫孵育15 min，非免疫血清封閉10 min，加一抗Caspase3(1:500)、Caspase8(1：200)、Caspase9(1:600)4℃ 6 h，加二抗，室溫下孵育10 min，加三抗室溫下孵育10 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。陰性對(duì)照切片用PBS 代替一抗，其他實(shí)驗(yàn)步驟不變。Caspase的陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞漿的棕黃色染色。通過(guò)IPP6圖像分析軟件計(jì)算其平均光密度值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有結(jié)果通過(guò)SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

放射組豚鼠60CO照射后第1、4、7天所有豚鼠聽泡內(nèi)無(wú)積液及膿性分泌物，第14天少數(shù)豚鼠有中耳積液予以剔除(放射組中不包括剔除的豚鼠)。

2.1ABR反應(yīng)閾 放射組豚鼠60CO照射后第4天ABR反應(yīng)閾與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，照射后第7、14天ABR反應(yīng)閾與對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表1)。

2.2HE染色結(jié)果 對(duì)照組豚鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)正常，無(wú)萎縮及缺失改變。而放射組豚鼠在照射后第4天出現(xiàn)較明顯的SGC萎縮，表現(xiàn)為細(xì)胞漿減少、細(xì)胞核濃縮凝集，照射后第7、14天SGC萎縮更明顯(圖1)。

2.3SGC的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 放射組SGC的Caspase8、Caspase 9、Caspase 3在螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的表達(dá)上調(diào)，照射后第1天、4天、7天和14天SGC的Caspase 8的平均光密度值與對(duì)照組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。照射后第4、7和14天SGC的Caspase 9的平均光密度值與對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。照射后第1、14天的Caspase 3平均光密度值與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，照射后第4、7天的Caspase 3平均光密度值與對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表1，圖2)。

3 討論

圖2 兩組豚鼠SGC免疫組織化學(xué)染色圖片(×400)a 對(duì)照組SGC Caspase3無(wú)明顯陽(yáng)性表達(dá)；b 放射組SGC Caspase3有陽(yáng)性表達(dá)；c 對(duì)照組SGC Caspase9無(wú)明顯陽(yáng)性表達(dá)；d 放射組SGC Caspase9有陽(yáng)性表達(dá)；e 對(duì)照組SGC Caspase8無(wú)明顯陽(yáng)性表達(dá)，f 放療組SGC Caspase8有陽(yáng)性表達(dá)

表1 放射后各組與對(duì)照組豚鼠ABR反應(yīng)閾及SGC Caspase9、Caspase3、Caspase8的平均光密度值比較

注：與對(duì)照組比較；*P<0.05，**P<0.01

頭頸部腫瘤放射治療常用的放射線如電子射線、β射線、γ射線以及快中子射線等均能引起聽覺(jué)系統(tǒng)的損傷，放射治療后引起的感音神經(jīng)性聾呈顯著的劑量相關(guān)性[5]。在電離輻射引起內(nèi)耳損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，單次照射40 Gy并不明顯引起聽力變化[6]，多次分割照射(每天一次2 Gy，每周5次)大于50 Gy時(shí)才可引起聽力的改變[7，8]。李熒等[9]報(bào)道給予豚鼠70 Gy照射后第3天行ABR測(cè)試，結(jié)果顯示聽力損失以輕中度為主，到第2周后出現(xiàn)中重度聽力損失。本研究采用一次性給予豚鼠耳顳部70 Gy劑量60CO照射后第14天時(shí)豚鼠出現(xiàn)中度的聽損傷，與其他學(xué)者的研究類似。

目前對(duì)于電離輻射首先損害耳蝸的哪一結(jié)構(gòu)還不清楚，許多學(xué)者經(jīng)動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，放療可導(dǎo)致內(nèi)耳螺旋器細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變[10，11]，放療對(duì)Corti器的損傷中，外毛細(xì)胞損傷比內(nèi)毛細(xì)胞損傷更嚴(yán)重。Gibb等[12]報(bào)道1例放射治療后7年死亡的鼻咽癌患者顳骨組織病理報(bào)告顯示，耳蝸Corti器內(nèi)毛細(xì)胞無(wú)缺失，外毛細(xì)胞散在缺失，血管紋片狀萎縮，有中重度耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的缺失，認(rèn)為放療后螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損害比Corti器更明顯。本研究發(fā)現(xiàn)一次性給予70 Gy60CO射線照射后，豚鼠早期(照射后第4天)即可出現(xiàn)較明顯的耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的萎縮改變。本研究只觀察了放射后14天以內(nèi)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷，在今后進(jìn)一步的研究工作中，可延長(zhǎng)觀察時(shí)程，同時(shí)觀察螺旋神經(jīng)細(xì)胞以及毛細(xì)胞放射線照射后的改變，以了解其對(duì)放射是否有不同的反應(yīng)。

Caspase 8是死亡受體凋亡途徑中的重要啟動(dòng)因子，Caspase 9是線粒體凋亡途徑中的重要啟動(dòng)子，Caspase 8、Caspase 9的啟動(dòng)活化均可以促進(jìn)Caspase3的活化，從而產(chǎn)生了蛋白水解作用形成的Caspase自我放大級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而裂解DNA損傷細(xì)胞[13]，引起細(xì)胞程序性死亡[14]。本研究結(jié)果表明60CO照射導(dǎo)致了豚鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Caspase8、Caspase9、Caspase3蛋白的表達(dá)上調(diào)，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)生萎縮改變，說(shuō)明60CO γ射線照射致豚鼠ABR反應(yīng)閾上升可能與耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的萎縮有關(guān)，而螺旋神經(jīng)節(jié)的萎縮可能與Caspase 8、Caspase9、Caspase3在螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

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