培養(yǎng)基組成對(duì)銅綠假單胞菌NY3產(chǎn)鼠李糖脂性能和結(jié)構(gòu)的影響

孫 超，郭 斐

鼠李糖脂是一種無毒且應(yīng)用廣泛的生物表面活性劑，具有乳化、起泡、殺菌、驅(qū)油等性能，同時(shí)可作為食品添加劑的表面活性劑，有著廣泛的應(yīng)用前景。鼠李糖脂在石油工業(yè)中主要應(yīng)用于三次采油和石油污染土壤修復(fù);在農(nóng)業(yè)中主要應(yīng)用于土壤性能的改良，保護(hù)植物以及作無污染殺菌劑使用;在環(huán)境修復(fù)中主要應(yīng)用于修復(fù)重金屬污染，實(shí)驗(yàn)證明鼠李糖脂對(duì)土壤中多種重金屬離子的洗脫能力強(qiáng)于普通的化學(xué)表面活性劑。

我們分離篩選出的銅綠假單胞菌NY3［1］能利用不同碳源和氮源發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂。通過改變培養(yǎng)基中的碳源和氮源，利用NY3菌發(fā)酵產(chǎn)生出結(jié)構(gòu)性能不同的鼠李糖脂，為有目的控制NY3菌株發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

銅綠假單胞菌NY3，本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定［2］。

1.1.2 培養(yǎng)基

NY3種子液培養(yǎng)基:牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，pH=7.0～7.2，蒸餾水定容至1 000 ml，121℃高壓蒸汽滅菌30 min。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基:NH4NO31.004 g(或含氮量相當(dāng)?shù)谋?中所列出的其他氮源)，磷酸鹽緩沖液30 mL (K2HPO442 g，NaH2PO428 g，pH7.5，蒸餾水定容至1 000 ml)，MgSO4溶液0.5 mL(24.64 g/L)，CaCl2溶液0.1 mL(CaCl2·2H2O 14.72 g/L)，微量元素1.5 mL(FeSO4·7H2O 4.5 g/L、ZnSO4·7H2O 0.148 g/L、MnSO4·4H2O 0.3 g/L、CoCl2·6H2O 0.024 g/L、NiCl2·6H2O 0.024 g/L、CuCl2·6H2O 0.017 g/L、Na2MoO4·2H2O 0.109 g/L、H3BO30.062 g/L)，置于1L容量瓶中，調(diào)節(jié)pH為9.0，蒸餾水定容至刻度。

鼠李糖脂發(fā)酵培養(yǎng)基:100 ml無機(jī)鹽培養(yǎng)基，加入5 ml菜籽油(或重量百分比為4.8%的表1中列出的其他碳源)，121℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 鼠李糖脂的發(fā)酵和提純

將NY3菌接種于100 ml NY3種子液培養(yǎng)基，置30℃搖床(170 r/min)好氧培養(yǎng)24 h，得NY3種子液。以1%接種量將其接種于100 ml鼠李糖脂培養(yǎng)基中，于30℃搖床(170 r/min)好氧培養(yǎng)72h，得含鼠李糖脂發(fā)酵液。再于10 000 r/min轉(zhuǎn)速、4℃離心10 min。用濃HCl調(diào)上清液pH=2，靜置4℃冰箱中過夜，即得發(fā)酵液。收集離心沉淀，在pH=2條件下洗滌沉淀，用1 mol/L的NaOH溶解，調(diào)pH= 7，冷凍干燥得到微生物表面活性劑粗品，用CH2Cl2抽提后減壓蒸干，溶于0.01 mol/L的NaOH溶液，再用Whatman No.4濾紙過濾，調(diào)濾液pH=2，于10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min，收集沉淀，真空干燥，即得鼠李糖脂純品［3］。

1.3 分析方法

1.3.1 發(fā)酵液性能分析方法

pH值測定:用pHS-3C酸度計(jì)測定。

排油圈直徑測定:取直徑10 cm培養(yǎng)皿一個(gè)，加20 ml水后，在中心加0.5 ml橄欖油，在油膜中心加0.1 ml發(fā)酵液，中心油膜被擠向四周形成一個(gè)圓，其直徑與表面活性劑的含量和活性成正比，測量排油圈直徑大小。

乳化性能測定:取10 ml刻度比色管，加5 ml航空煤油和5 ml發(fā)酵液，搖動(dòng)混合30 s，靜置數(shù)分鐘，重復(fù)三次，讀取乳化層體積并觀察其穩(wěn)定性。

表面張力測定:使用最大氣泡法進(jìn)行測量。

1.3.2 鼠李糖脂性能分析方法

含糖量測定:蒽酮 -硫酸法［4］，在試管中加0.2%的蒽酮-濃硫酸4 mL為顯色劑，沿試管壁滴加樣品1 mL，冷卻后沸水浴加熱20 min，于30 min內(nèi)在553 nm處測定OD值。

紅外光譜測定:將提純的鼠李糖脂與KBr粉末壓片，放入紅外光譜儀中掃描，得到紅外光譜圖。

不飽和鍵含量測定:利用碘量法［5］進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源對(duì)NY3菌發(fā)酵產(chǎn)表面活性劑特性的影響

大量實(shí)驗(yàn)表明［1］，NY3菌能利用多種碳源發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂。以硝酸銨為氮源，按照1.2中的實(shí)驗(yàn)方法制得發(fā)酵液和鼠李糖脂后以1.3的分析方法測定其各項(xiàng)性能，結(jié)果如表1所示。

表1 不同碳源制得發(fā)酵液和鼠李糖脂性能測定結(jié)果

表1結(jié)果表明，發(fā)酵碳源不同，發(fā)酵液的性能有較大差別。以菜籽油和橄欖油為碳源時(shí)，發(fā)酵液具有極好的排油和乳化性能，且其表面張力分別降到25.92、25.49 mN/m，純鼠李糖脂含糖量分別為15.38%、12.24%，相對(duì)較低。而以丙三醇和葡萄糖為碳源時(shí)，NY3發(fā)酵液具有較好的排油性能和較差的乳化性能，發(fā)酵液的表面張力分別降到27.33、 30.17 mN/m，純鼠李糖脂含糖量達(dá)到28.62%、23.22%，這說明它們具有更好的水溶性。

按照1.3.2的分析方法測定純化后鼠李糖脂的紅外光譜，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同碳源NY3發(fā)酵產(chǎn)的鼠李糖脂紅外光譜

圖1中3 437 cm-1吸收帶由鼠李糖環(huán)上OH的伸縮振動(dòng)吸收引起;2 920 cm-1、2 850 cm-1是由脂鏈中甲基和亞甲基C-H對(duì)稱與不對(duì)稱伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰;1 750 cm-1為 C=O吸收帶，1 055 cm-1為C-O-C伸縮振動(dòng)吸收帶，說明分子中有五圓環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)和糖苷鍵存在;3 007 cm-1處有一明顯小峰，應(yīng)為不飽和雙鍵C=C吸收峰，說明分子中有不飽和鍵。按照前期有關(guān)NY3發(fā)酵產(chǎn)表面活性劑的研究結(jié)果［1］和圖1中的紅外譜圖結(jié)果，NY3菌用不同碳源發(fā)酵所產(chǎn)表面活性劑為鼠李糖脂類化合物?？捎? 437 cm-1峰面積和2 920 cm-1～2 850 cm-1處面積比衡量鼠李糖脂中糖含量，該比值越大，糖含量相對(duì)越高。利用Origin8軟件計(jì)算該比值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菜籽油、丙三醇、橄欖油、葡萄糖分別為碳源時(shí)，該比值為 1.322、18.778、0.706、6.528，因此，丙三醇為碳源所產(chǎn)鼠李糖脂糖含量最高，橄欖油為碳源所產(chǎn)鼠李糖脂糖含量最低。鼠李糖脂含糖量高其水溶性好，含糖量小則排油效果好，因此，紅外光譜測定結(jié)果和發(fā)酵液性能測定結(jié)果是一致的。

2.2 氮源對(duì)NY3菌發(fā)酵產(chǎn)表面活性劑特性的影響

以菜籽油為碳源，NY3在不同氮源條件下生產(chǎn)的鼠李糖脂也具有不同的特性和結(jié)構(gòu)，試驗(yàn)選取了4種具有代表性的氮源，為降低加入種子液給發(fā)酵液帶來的影響，接種量減小為0.5%，氮源的量增大到原來的1.5倍，其測定結(jié)果如表2。

表2 不同氮源制得發(fā)酵液和鼠李糖脂性能測定結(jié)果

表2結(jié)果表明，硝酸銨和硝酸鈉為氮源時(shí)，NY3發(fā)酵液有極好的排油和乳化性能，表面張力降到25.92、24.64 mN/m，純鼠李糖脂含糖量為15.38%、17.16%;而以氯化銨為氮源時(shí)，NY3發(fā)酵液的排油性能和乳化性能很差，表面張力為66.93 mN/m，接近蒸餾水的，純鼠李糖脂含糖量為10.77%;蛋白胨為氮源時(shí)，NY3發(fā)酵液有較好的排油和乳化性能，發(fā)酵液的表面張力為27.07 mN/m，純鼠李糖脂含糖量為15.26%。

按照1.3.2的分析方法，測定純化后鼠李糖脂的紅外光譜(圖2)。

圖2 不同氮源NY3發(fā)酵產(chǎn)的鼠李糖脂紅外光譜

如圖2所示，NY3在4種不同氮源培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂的吸收峰都相同或是有少許移位，總體差異并不大，因此，仍為鼠李糖脂類。較為明顯的差別為羥基的吸收峰和C=C的吸收峰，其中氮源為硝酸鹽時(shí)，沒有出現(xiàn)明顯的不飽和鍵(包括硝酸鉀等)，而有銨鹽、硝酸銨、蛋白胨等為氮源時(shí)，不飽和鍵就會(huì)很明顯。

用3 437 cm-1峰面積和 2 920 cm-1～2 850 cm-1處面積比衡量鼠李糖脂含糖量。硝酸銨、硝酸鈉、氯化銨、蛋白胨為氮源時(shí)，該比值分別為1.322、1.471、0.519、0.534。因此，氮源對(duì)NY3產(chǎn)鼠李糖脂含糖量影響不大。氮源為氯化銨生產(chǎn)的鼠李糖脂含糖量最低，為10.77%，且具有破乳性能。氨氮為氮源產(chǎn)鼠李糖脂含不飽和鍵，有抗氧化性。按照1.3中的碘量法測定4種氮源所產(chǎn)鼠李糖脂的不飽和鍵含 量，分別為 14.02、0、10.93、13.64 mmol/g。

3 結(jié)論

銅綠假單胞菌NY3能利用多種碳源和氮源發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂，且碳源、氮源不同，鼠李糖脂化學(xué)組成和產(chǎn)量有明顯的差別，使得發(fā)酵液的乳化、排油等性能及其表面張力有較大差異。通過研究獲得以下結(jié)論:

(1)菜籽油和橄欖油為碳源，所產(chǎn)鼠李糖脂含糖量低，發(fā)酵液有好的排油性能，且表面張力較低;丙三醇和葡萄糖為碳源，所產(chǎn)鼠李糖脂含糖量高，其水溶性好;菜籽油、橄欖油、丙三醇、葡萄糖為碳源得鼠李糖脂產(chǎn)量分別為 12.78、5.19、14.02、2.08 g/L。

(2)硝酸銨和硝酸鈉為氮源，NY3發(fā)酵液有極好的排油和乳化性能，表面張力下降顯著，提純的鼠李糖脂含糖量為15.38%、17.16%;氯化銨為氮源，NY3發(fā)酵液的排油性能和乳化性能很差，表面張力接近蒸餾水的，提純的鼠李糖脂含糖量較低;蛋白胨為氮源，NY3發(fā)酵液具有較好的排油和乳化性能，表面張力降到27.07 mN/m，提純的鼠李糖脂含糖量為15.26%。硝酸銨、硝酸鈉、氯化銨、蛋白胨為氮源得鼠李糖脂產(chǎn)量分別為12.75、12.36、2.65、9.48 g/L。

(3)氨氮為氮源產(chǎn)鼠李糖脂含不飽和鍵，有抗氧化性。硝酸銨、氯化銨、蛋白胨為氮源時(shí)，不飽和鍵含量為14.02、10.93、13.64 mmol/g。

［1］劉超.銅綠假單胞菌NY3產(chǎn)表面活性劑發(fā)酵條件優(yōu)化及表面活性劑性能研究［D］.陜西:西安建筑科技大學(xué)，2011.

［2］惠艷.優(yōu)良菌種降解烴類污染物相互作用關(guān)系研究［D］.陜西，西安建筑科技大學(xué)，2009.

［3］馬滿英，施周，劉有勢等.預(yù)處理酸沉淀冷凍干燥法提取鼠李糖脂新工藝［J］，湖南大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，35(1):75-78.

［4］盧國滿，劉紅玉等.鼠李糖快速分析方法及其影響因素研究［J］，微生物學(xué)通報(bào)，2006，33(4):106-111.

［5］國家環(huán)境保護(hù)總局《空氣和廢氣監(jiān)測分析方法》編委會(huì).空氣和廢氣監(jiān)測分析方法［M］.第四版增補(bǔ)版.北京:中國環(huán)境科學(xué)出版社，2008:421-422.