烏頭多糖的提取分離與含量測定

葉思勇 邵孟霞 陳智

[摘要] 目的：從中藥烏頭（Aconitum Paniculigerum Nakai）中提取多糖并對其進行含量測定。方法：乙醇超聲提取得到多糖，采用蒽酮-硫酸比色法、紫外可見分光光度法對其進行含量測定，檢測波長為（490±1） nm。結(jié)果：烏頭多糖在0.020 2～0.101 0 mg/ml范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，r=0.999 7，平均回收率為100.60%，RSD=1.97%。藥材中多糖以葡萄糖為標準含量，含量為15.82%。結(jié)論：該方法準確快速、重現(xiàn)性好。

[關(guān)鍵詞] 烏頭；多糖；提??；蒽酮-硫酸法

[中圖分類號] R283.1 [文獻標識碼] A[文章編號]1673-7210（2011）11（c）-070-02

Studies on extraction and determination of polysaccharide in Aconitum Paniculigerum Nakai

YE Siyong, SHAO Mengxia, CHEN Zhi

Department of Pharmacy, the Second People's Hospital of Ji'nan City, Shandong Province, Ji'nan 250001, China

[Abstract] Objective: To extract and determine the content of polysaccharide in Aconitum Paniculigerum Nakai. Methods: Polysaccharide was abtained by ethanol, and the content of polysaccharide was identified by anthrone-sulfuricacid colorimetry and UV method with the wavelength was (490±1) nm. Results: Polysaccharide had a good linearity within 0.020 2-0.101 0 mg/ml (r=0.999 7), the average recovery was 100.60% and RSD was1.97%. Conclusion: This method is quick, accurate and reliable for determination of Aconitum Paniculigerum Nakai.

[Key words] Aconitum Paniculigerum Nakai; Polysaccharide; Extraction; Anthrone-sulfuricacid determination

圓錐烏頭（Aconitum Paniculigerum Nakai）是烏頭的一種，屬毛茛科烏頭屬，其塊根呈不規(guī)則倒圓錐形，圓錐烏頭資源較豐富，該塊根在吉林、遼寧等地做草烏用[1]，植物多糖廣泛的生物活性已逐漸被人們利用，其獨特活性和來源的天然性在保障人體健康應用中具有很大潛力[2-3]。藥理研究表明，從烏頭水提物中得到的烏頭多糖具有降血糖作用[4]，本實驗對烏頭多糖提取工藝進行初步研究，旨在為烏頭多糖的提取和開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV－3010型紫外可見分光光度計（日本日立）；FA1104型電子天平（上海天平儀器廠）；儀表恒溫水浴鍋（黃驊市綜合電器廠）；Zk-92A真空干燥箱（上海實驗儀器廠）。

1.2 試劑

蒸餾水、95％乙醇、蒽酮、濃硫酸等試劑均為分析純；無水葡萄糖標準品由中國藥品生物制品檢定所提供，批號：0833-9501，烏頭購于山東建聯(lián)藥店，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室鑒定為毛茛科植物烏頭的塊根。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖的提取分離

稱取干燥的圓錐烏頭粉末5 g，共9份，加入一定量的95%乙醇超聲提取一定時間后，離心，棄上清液，留藥渣，自然揮干至無醇味。按照L9（34）正交設計試驗表對提取次數(shù)、溶劑用量、浸漬溫度、提取時間4因素進行考察。由方差分析優(yōu)選最佳提取工藝，結(jié)果最佳提取工藝為：提取次數(shù)為3次，溶劑用量為20倍量，浸漬溫度為45℃，提取時間為40 min。

2.2 烏頭多糖含量測定方法學研究

2.2.1 葡萄糖對照品溶液的制備精密稱定干燥至恒重的葡萄糖對照品16.83 mg置于25 ml容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，配成0.673 mg/ml的儲備液。精密吸取0.673 mg/ml葡萄糖對照品溶液3 ml定容至25 ml容量瓶中，得葡萄糖對照品溶液0.080 8 mg/ml。

2.2.2 供試品溶液的制備精密稱定多糖0.151 0 g于25 ml容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，得6.04 mg/ml的多糖溶液。

2.2.3 蒽酮-硫酸試液的制備精密稱量0.2 g蒽酮，將其溶解到5 ml乙醇中，再于100 ml容量瓶中以75%硫酸定容，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3 最大吸收波長的選擇

精密吸取0.080 8 mg/ml的葡萄糖對照品溶液2 ml和6.04 mg/ml的多糖溶液2 ml于試管中，冷水浴5 min，加入蒽酮-硫酸試液8 ml搖勻，立即置沸水浴加熱10 min，立即置冷水中冷卻至室溫40 min，以2 ml蒸餾水代替葡萄糖溶液如上法配制空白，用紫外可見分光光度計在500～750 nm內(nèi)進行波長掃描。結(jié)果表明，在波長為（490±1） nm處溶液有最大吸收，故選擇（490±1） nm作為檢測波長。

2.4 標準曲線的制備

用0.080 8 mg/ml的葡萄糖對照品溶液中分別配制0.020 2、0.040 4、0.060 6、0.080 8、0.101 0 mg/ml 5個不同濃度的對照品系列溶液。分別精密吸取2 ml置具塞試管中，冷水浴5 min，加入蒽酮-硫酸試液8 ml搖勻，立即置沸水浴加熱10 min，取出用冷水冷卻至室溫，室溫放置40 min，以2 ml蒸餾水代替葡萄糖溶液如上法配制空白，于625 nm處測定吸光度。以吸光度（Y）對葡萄糖濃度(mg/ml)（X）進行線性，得回歸方程為Y=6.445 5X+0.016 6 （r=0.999 8），表明在0.020 2～0.101 0 mg/ml范圍內(nèi)葡萄糖含量與吸光度呈良好的線性關(guān)系。見圖1。

2.5 精密度試驗

精密吸取2 ml供試品溶液，共6份，按“標準曲線的制備”項下操作，分別測定吸收度。結(jié)果顯示，RSD=0.22%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取2 ml樣品溶液，按“標準曲線的制備”項下操作，置陰暗處室溫條件下放置，分別于0、30、60、90、120、150 min測定吸光度，以此考察其穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，RSD=0.17%（n=6），表明樣品溶液在150 min內(nèi)顯色穩(wěn)定，可進行測定。

2.7 重現(xiàn)性試驗

精密稱取同批樣品粉末1 g，共6份，按“多糖的提取分離”項下操作制備多糖，按“供試品溶液的制備”項下操作制備供試品溶液，按“標準曲線的制備”項下操作，分別測定吸光度。結(jié)果顯示，RSD=0.23%（n=6），表明此測定方法重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱定多糖樣品50 mg，共6份，分別加入葡萄糖對照品0.7 mg，按“供試品溶液的制備”和“標準曲線的制備”項下操作，測定各試驗液中多糖的量，并計算回收率。結(jié)果顯示，樣品回收率RSD=1.97%（n=6），表明該方法準確度高。見表1。

2.9 含量測定

精密吸取“2.2.2”項下供試品溶液2.5 ml于25 ml容量瓶中，定容至刻度，分別吸取2 ml至具塞試管中，按“標準曲線的制備”項下操作，測定吸光度，平行測定3次，計算平均值，按標準曲線方程計算藥材中多糖含量。實驗結(jié)果表明，藥材中的多糖以葡萄糖為標準含量，含量為15.82%。見表2。

3 討論

3.1 多糖的含量測定

植物多糖組成復雜，獲得相應多糖對照品也比較困難，在多糖含量測定時，往往采用單糖如葡萄糖代替對照品，以測定樣品多糖的相對含量。本法的原理為糖類在強酸作用下脫水生成糖醛及其衍生物，與蒽酮縮合生成有色物質(zhì)，其生成量可用于其定量研究。

3.2 多糖測定的準確度

蒽酮-硫酸比色法測定烏頭多糖時，采用冰水浴中加入硫酸-蒽酮溶液，可提高烏頭多糖測定的準確度。

3.3 蒽酮-硫酸法測定烏頭多糖含量的優(yōu)點

在最佳操作條件下，利用蒽酮-硫酸法測定烏頭多糖含量的精密度試驗RSD為0.22%，平均回收率為100.60%，RSD為1.97%，測得樣品中烏頭多糖含量為15.82%，提示本法簡單、顯色穩(wěn)定、靈敏度高、重現(xiàn)性好。

[參考文獻]

[1]肖培根.中藥志[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1979:128.

[2]王庭欣,王庭祥,龐佳宏.植物多糖生物活性研究進展[J].食品研究與開發(fā),2005,26(2):200-202.

[3]張憲黨,馬馳,張群,等.植物多糖抗輻射損傷作用研究進展[J].中國輻射衛(wèi)生,2003,12(2):122-123.

[4]Konno C, Murayama M, Sugiyama K, et al. Isolation and Hypoglycemic Activity of Aconitans A, B, C and D, glycans of Aconitum camichaeli Roots1 [J]. Planta Med,1985,4(2):160.

（收稿日期：2011-06-03）

[作者簡介] 葉思勇（1970.6-），男，本科，主管藥師；研究方向：制劑學。