應(yīng)用Fluoro-Jade C評價小鼠匹羅卡品模型中紋狀體神經(jīng)變性

王蓮 魏玲 付莉

[摘要] 目的：應(yīng)用Fluoro-Jade C（FJC）染色方法在小鼠匹羅卡品癲癇模型中探測紋狀體結(jié)構(gòu)中神經(jīng)元的變性情況，以了解紋狀體結(jié)構(gòu)在慢性顳葉癲癇發(fā)生中的病理神經(jīng)基礎(chǔ)。方法：雄性昆明小鼠10只（對照組5只，模型組5只）。在癲癇持續(xù)狀態(tài)后3 d處死模型組小鼠。在紋狀體水平切制冠狀切片，行FJC染色，在熒光顯微鏡下觀察FJC陽性細(xì)胞的形態(tài)和在紋狀體（尾狀殼核）中的整體分布情況。結(jié)果：在模型組，F(xiàn)JC染色的腦切片上清楚顯示FJC陽性變性細(xì)胞呈亮黃綠色，呈神經(jīng)元形態(tài)，胞體和突起均清晰顯示。在紋狀體（尾狀殼核）內(nèi)背側(cè)1/3和尾側(cè)部分出現(xiàn)許多FJC陽性細(xì)胞。結(jié)論：本研究運(yùn)用FJC染色技術(shù)在小鼠匹羅卡品癲癇模型中顯示紋狀體中發(fā)生了神經(jīng)元變性，提示紋狀體可能在慢性顳葉癲癇的發(fā)生機(jī)制中起重要作用。

[關(guān)鍵詞] Fluoro-Jade C；癲癇；匹羅卡品；神經(jīng)變性

[中圖分類號] R742.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1673-7210（2011）11（c）-021-03

Fluoro-Jade C staining in the assessment of neurodegeneration in the striatum of Pilocarpine-treated mice

WANG Lian, WEI Ling, FU Li

Local Cadres Ward, Kunming General Hospital of Chengdu Military Region, Yunnan Province, Kunming 650032, China

[Abstract] Objective: To detect degenerative neurons by Fluoro-Jade C (FJC) that may occurred in the striatum of pilocarpine-treated mice and to understand the pathologically neural basis of striatum in chronic epilepsy. Methods: Male adult mice (Kunming stain, n=10) were divided into Pilocarpine-treated group (n=5) and control group (n=5). Pilocarpine-treated mice were sacrificed at 3 d after status epilepticus. Brain coronal sections in the striatum levels were subject to FJC staining. Finally, FJC-stained brain and overall distribution of the Fluoro-Jade C positive cells sections were examined under an epifluorescence microscope to identify the shape in the striatum (caudate putamen). Results: The FJC-positive staining cells showed a bright green color in the somas and fine processes with neuronal profiles. Numerous degenerating cells could be seen in the medial dorsal one-third and caudal part of the striatum (caudate putamen). Conclusion: Massive neurodegeneration are demonstrated by FJC staining in the striatum of Pilocarpine-treated mice, suggesting that the striatum may play a role in recurrent seizure mechanism of chronic epilepsy.

[Key words] Fluoro-Jade C; Epilepsy; Pilocarpine; Neurodegeneration

顳葉癲癇是人類癲癇的常見形式，治療難度大，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前仍有許多問題有待解決。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中許多關(guān)鍵性區(qū)域涉及顳葉癲癇的發(fā)作，如基底節(jié)在癲癇活動的啟動和傳播方面起重要作用[1]。在本研究中筆者應(yīng)用新近發(fā)展的一類陰離子熒光配體組化染料Fluoro-Jade C（FJC，特異性標(biāo)記中樞神經(jīng)系統(tǒng)中正在變性的神經(jīng)元[2-4]）和小鼠匹羅卡品顳葉癲癇模型研究了紋狀體神經(jīng)元的變性情況，深入了解慢性顳葉癲癇中癲癇反復(fù)發(fā)作的神經(jīng)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動物為雄性昆明小鼠10只，鼠齡4～5周，體重20～25 g。試劑鹽酸匹羅卡品（P6503）購自Sigma公司，使用前溶于生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為10 mg/ml的溶液；硫酸阿托品注射劑（規(guī)格1 ml：0.5 mg；批號：091203）購自太極集團(tuán)西南藥業(yè)股份有限公司，配置成質(zhì)量濃度為0.25 mg/ml的溶液；苯巴比妥鈉注射液（規(guī)格1 ml：0.1 g；批號：100701）購自上海新亞藥業(yè)有限公司；FJC（AG325）購自美國Chemicon公司。染液配制：用5%的NaOH溶液20 ml和100%乙醇80 ml配制成1%NaOH-80%乙醇混合液；用0.03 g高錳酸鉀和50 ml蒸餾水配制成0.06%高錳酸鉀溶液；10 ml蒸餾水和0.01 g FJC粉劑配制成質(zhì)量濃度為0.1%的FJC儲存液；用10 ml蒸餾水、10 μl 0.1% FJC儲存液和10 μl醋酸液稀釋成0.000 1% FJC工作液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將10只小鼠隨機(jī)分為兩組，每組5只，其中一組采用阿托品和生理鹽水腹腔注射（對照組），另一組給予阿托品和匹羅卡品腹腔注射（模型組）。模型組小鼠在注射匹羅卡品前15 min，先腹腔注射阿托品（1 mg/kg），后腹腔注射匹羅卡品（首次量220 mg/kg），若未出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE），則每隔30 min追加注射（每次1/3首次量），最終制成SE模型小鼠。癲癇發(fā)作嚴(yán)重性參照Racine分級：凝視不動為Ⅰ級，姿勢僵硬為Ⅱ級，頭部顫動及重復(fù)動作為Ⅲ級，后腿站立及肌陣攣為Ⅳ級，嚴(yán)重強(qiáng)直陣攣發(fā)作為Ⅴ級。在本實(shí)驗(yàn)中用于組織切片制備的是表現(xiàn)Ⅲ~Ⅳ級發(fā)作的小鼠。SE后60 min，腹腔注射苯巴比妥（45 mg/kg）終止SE；SE后2 h，腹腔注射生理鹽水（0.8～1.0 ml/只）。在對照組，用等體積的生理鹽水代替匹羅卡品，其他同模型組。生理鹽水處理的小鼠無癲癇活動出現(xiàn)。

1.3 組織制備

小鼠通過經(jīng)心灌注固定處死，模型組小鼠在SE后3 d時處死，對照組小鼠也在3 d時處死。腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）深度麻醉小鼠，開胸，經(jīng)左心室至升主動脈插管，生理鹽水（15 ml）灌注，然后用40 ml質(zhì)量濃度4%多聚甲醛溶液先快后慢灌注固定。取鼠腦在4℃條件下置多聚甲醛溶液中后固定，最后將鼠腦置于質(zhì)量濃度20%蔗糖溶液在4℃條件下沉底。用O.C.T.復(fù)合物包埋腦組織、冰凍，在紋狀體水平用恒冷箱冰凍切片機(jī)切制厚14 μm的冠狀切片，貼于涂有明膠的載玻片上，晾干后進(jìn)行FJC染色。

1.4 FJC染色

切片按先后順序置于1%NaOH-80%乙醇混合液5 min，70%乙醇2 min，蒸餾水2 min，0.06%高錳酸鉀溶液10 min，蒸餾水2 min。取出切片后將0.000 1% FJC染液滴于切片上反應(yīng)10 min（避免強(qiáng)光照射），再將切片用蒸餾水漂洗3次（1 min/次），晾干，二甲苯透明1 min。用中性樹膠封片后在Olympus BX60熒光顯微鏡下采用藍(lán)色濾色片觀察并采集圖像。組織結(jié)構(gòu)和命名參照Paxinos和Franklin的小鼠圖譜[5]。

2 結(jié)果

2.1 FJC陽性變性神經(jīng)元的形態(tài)

在模型組，F(xiàn)JC染色的腦切片上染色背景很淺，F(xiàn)JC陽性變性細(xì)胞呈亮黃綠色，呈神經(jīng)元形態(tài)，胞體和突起均清晰顯示（圖1）。在對照組未見FJC陽性細(xì)胞。

2.2 腦結(jié)構(gòu)變化和FJC陽性變性神經(jīng)元在紋狀體的分布

在模型組，發(fā)生SE的小鼠側(cè)腦室和第三腦室擴(kuò)大。紋狀體（尾狀殼核）內(nèi)背側(cè)1/3和尾側(cè)部分見到許多FJC陽性細(xì)胞（圖2）。

3 討論

確定皮質(zhì)和皮質(zhì)下區(qū)特定區(qū)域在癲癇發(fā)作中的作用能更好地了解癲癇的發(fā)生機(jī)制和行為損害，也有利于為癲癇的預(yù)防和治療提供靶點(diǎn)[6]。許多關(guān)鍵腦區(qū)參與癲癇活動的產(chǎn)生和傳播[7]。在本研究中，筆者應(yīng)用一種陰離子熒光配體即FJC在昆明小鼠匹羅卡品顳葉癲癇模型中探測變性細(xì)胞，結(jié)果顯示在紋狀體（尾狀殼核）內(nèi)背側(cè)1/3和尾側(cè)部分發(fā)現(xiàn)許多FJC陽性細(xì)胞，提示了SE后在這些區(qū)域發(fā)生了神經(jīng)元變性。

越來越多的證據(jù)顯示，皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)在癲癇發(fā)作的行為學(xué)表現(xiàn)、癲癇活動的擴(kuò)布甚至啟動方面起作用[8]?；坠?jié)是感覺運(yùn)動皮質(zhì)和邊緣系統(tǒng)之間的交通中心，參與運(yùn)動性癲癇到執(zhí)行靶點(diǎn)的傳播及邊緣結(jié)構(gòu)中癲癇活動的產(chǎn)生[9]。紋狀體是基底節(jié)的接受部分，接受來自大腦皮質(zhì)的輸入。皮質(zhì)紋狀體興奮性谷氨酸傳導(dǎo)調(diào)節(jié)紋狀體內(nèi)的多個位點(diǎn)[4]。腹側(cè)杏仁核傳出通路直接從杏仁體投射到腹側(cè)紋狀體，其中一些密集地投射到殼核和蒼白球[8]。

自19世紀(jì)開始，基底節(jié)在前腦癲癇傳播中的作用引起了相關(guān)專家的興趣。Turski等[9]應(yīng)用系統(tǒng)注射匹羅卡品誘發(fā)邊緣性癲癇來研究基底節(jié)內(nèi)調(diào)節(jié)癲癇發(fā)作閾值的神經(jīng)元途徑，在尾狀核和殼核中雙側(cè)微注射興奮性氨基酸衍生物N-甲基-D-天（門）冬氨酸（當(dāng)注射入大腦皮質(zhì)、杏仁核或海馬時為強(qiáng)有力的致驚厥劑）時可拮抗匹羅卡品誘導(dǎo)的邊緣性癲癇。這種抗驚厥作用在整個尾狀核-殼核均可觀察到，但是尾狀核-殼核的腹后部分作用最顯著。通過雙側(cè)微注射神經(jīng)興奮毒素鵝膏蕈氨酸來損害尾狀核-殼核則使匹羅卡品的致癲用量減少。通過阻斷黑質(zhì)網(wǎng)狀部或腳內(nèi)核內(nèi)的γ-氨基丁酸（GABA）介導(dǎo)的抑制可使尾狀核-殼核的抗驚厥作用逆轉(zhuǎn)。結(jié)果提示尾狀核-殼核及其GABA依賴的傳出途徑調(diào)節(jié)邊緣結(jié)構(gòu)的癲癇發(fā)作閾值。

臨床影像學(xué)研究也顯示，在顳葉癲癇患者發(fā)作期間常觀察到尾狀核、殼核和丘腦出現(xiàn)發(fā)作期高灌注。此觀察和術(shù)后同側(cè)尾狀核代謝減低的研究提示在顳葉和紋狀體之間有共同的功能聯(lián)系[10]?；坠?jié)和額顳葉之間有許多聯(lián)系，因此基底節(jié)的高灌注可能是經(jīng)皮質(zhì)紋狀體連接由皮質(zhì)灶繼發(fā)皮質(zhì)下激活所致[11]。用發(fā)作期單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層減影和磁共振成像配準(zhǔn)[subtraction ictal single-photon-emission computed tomography（SPECT）coregistered to magnetic resonance imaging（MRI），SISCOM]復(fù)合技術(shù)對顳葉內(nèi)側(cè)癲癇患者的研究資料最常顯示在前顳區(qū)出現(xiàn)發(fā)作時高灌注，并常同時累及基底節(jié)和島葉，這可能代表了癲癇傳播的主要區(qū)域，可能是由于致癲灶觸發(fā)的神經(jīng)元過度活動擴(kuò)展所致[11-12]。另外，因?yàn)榧y狀體和丘腦通過穹隆和乳頭體接受來自海馬和杏仁核的大量纖維支配，所以海馬的細(xì)胞喪失導(dǎo)致了到同側(cè)紋狀體和丘腦的輸出減少，因此在顳葉癲癇患者出現(xiàn)皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)低代謝。對頑固性顳葉內(nèi)側(cè)癲癇患者進(jìn)行基于像素的形態(tài)定量研究顯示中腦、皮質(zhì)下核（如丘腦和尾狀核）及頂枕區(qū)顯示灰質(zhì)密度降低[10]。這提示在功能和解剖上與海馬聯(lián)系的腦區(qū)出現(xiàn)容積縮小。Geary等[8]的研究也顯示了相似的結(jié)果。

總之，本研究不僅證實(shí)FJC在檢測神經(jīng)元變性方面敏感、可靠、簡單，而且提示紋狀體可能在慢性顳葉癲癇的發(fā)生機(jī)制中起重要作用，從治療干預(yù)的可能性角度考慮，這有助于探測神經(jīng)保護(hù)措施以預(yù)防或減輕癲癇發(fā)作。

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（收稿日期：2011-07-26）

[作者簡介] 王蓮，女，博士，主治醫(yī)師；研究方向：癲癇。