HPLC法同時(shí)測(cè)定雙黃連膠囊中黃芩苷、黃芩素的含量

徐占方 楊秀美 潘鵬飛

[摘要] 目的：建立反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定雙黃連膠囊中黃芩苷、黃芩素的含量。方法：采用Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以甲醇-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm，流速為1.0 ml/min，進(jìn)樣量為10 μl，柱溫為30℃。結(jié)果：黃芩苷在6.072～151.800 μg/ml范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系，r=1.000 0（n=7）；黃芩素在2.124～53.100 μg/ml范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系，r=0.999 4（n=7）。黃芩苷的平均回收率為99.21%，RSD為0.5%（n=6）；黃芩素的平均回收率為99.12%，RSD為0.6%（n=6）。結(jié)論：本法操作簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于雙黃連膠囊的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 含量測(cè)定；黃芩苷；黃芩素；高效液相色譜法

[中圖分類(lèi)號(hào)] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)]1673-7210（2011）11（c）-067-03

Simultaneous determination of contents of Baicalin and Baicalein in Shuanghuanglian Capsules by high performance liquid chromatography

XU Zhanfang1, YANG Xiumei2, PAN Pengfei1

1.Jixi Food and Drug Control and Detection Center in Heilongjiang Province, Jixi 158100, China; 2.Department of Nursing, Jiguan District Hospital in Jixi City, Heilongjiaing Province, Jixi 158100, China

[Abstract] Objective: To establish simultaneous determination of the contents of Baicalin and Baicalein in Shuanghuanglian Capsules by high performance liquid chromatography (HPLC). Methods: With methanol-0.1% phosphoric acid solution as the mobile phase gradient elution, the Agilent Eclipse XDB-C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm) chromatographic column was used; the detection wavelength was 277 nm; the flow rate was 1.0 ml/min; the injection volume was 10 μl; the column temperature was 30℃. Results: The Baicalin showed a favorable linear relationship in the range of 6.072-151.800 μg/ml, r=1.000 0 (n=7), while the Baicalein showed a favorable linear relationship in the range of 2.124-53.100 μg/ml, r=0.999 4 (n=7). The average recovery rate of Baicalin was 99.21%, with the relative standard deviation (RSD) was 0.5% (n=6), while the average recovery rate of Baicalein was 99.12%, with the RSD was 0.6% (n=6). Conclusion: This method is simple, fast and accurate, therefore it can be used for the quality control of Shuanghuanglian capsules.

[Key words] Content determination; Baicalin; Baicalein; High performance liquid chromatography

雙黃連膠囊由金銀花、黃芩和連翹三味中藥組成，具有辛涼解表、清熱解毒之功效，可用于發(fā)熱、咳嗽、咽痛等[1]。黃芩的主要成分有黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素[2]，雙黃連膠囊中黃芩苷的HPLC法測(cè)定[3]已有報(bào)道，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有黃芩中黃芩苷的定量檢測(cè)，然而黃芩苷在內(nèi)源酶催化水解作用下，產(chǎn)生大量的黃芩素[4]，僅以黃芩苷一個(gè)指標(biāo)不能全面評(píng)價(jià)黃芩的質(zhì)量。本文同時(shí)測(cè)定雙黃連膠囊中黃芩苷、黃芩素2種主要成分的含量，結(jié)果表明，供試品在高效液相色譜中分離效果好，陰性樣品溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于雙黃連膠囊中黃芩的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

HP1100高效液相色譜儀Agilent 1200LC工作站，METTLER TOLEDO電子天平AG285，KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器，SHIMADZU UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110715-200815，含量為95.2%，中國(guó)藥品生物制品檢定所），黃芩素對(duì)照品（批號(hào)：111595-200604，中國(guó)藥品生物制品檢定所），雙黃連膠囊（市售樣品3批，批號(hào)：110101、091212、100701），其他試劑均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以甲醇（A）-0.1%磷酸酸溶液（B）為流動(dòng)相梯度洗脫：40%A（0 min），80%A（40 min），40%A（60 min），檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm，流速為1.0 ml/min，進(jìn)樣量為10 μl，柱溫為30℃。理論板數(shù)不低于10 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液制備精密稱(chēng)取樣品適量，約0.24 g置100 ml容量瓶中，加70%乙醇80 ml，超聲提取30 min，放置至室溫，加70%乙醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密吸取2 ml置10 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，備用。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備分別精密稱(chēng)取P2O5干燥過(guò)夜的黃芩苷、黃芩素對(duì)照品31.89 mg和10.62 mg，置同一50 ml容量

瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，用甲醇稀釋至刻度，濾過(guò)，精密吸取2 ml置20 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度作為混合

對(duì)照品溶液。

2.2.3 空白溶液制備按雙黃連膠囊的處方、制法不加黃芩粉末，制備陰性樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制成空白對(duì)照溶液。

2.3 線(xiàn)性關(guān)系考察

取混合對(duì)照品貯備液搖勻，濾過(guò)，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 μl，以峰面積Y對(duì)濃度X（μg/ml）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得黃芩苷回歸方程為Y=31.87X-7.453，r=1.000 0（n=7），表明黃芩苷在6.072～151.800 μg/ml范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好；黃芩素回歸方程為Y=48.27X+29.04，r=0.999 4（n=7），表明黃芩素在2.124～53.100 μg/ml范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液（濃度為黃芩苷60.72 μg/ml，黃芩素21.24 μg/ml），重復(fù)進(jìn)樣5次，每次10 μl，測(cè)得黃芩苷峰面積值的RSD為0.2%（n=5），黃芩素峰面積值的RSD為0.6%（n=5），表明本方法精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取樣品適量，按“2.2.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、16、24 h，重復(fù)進(jìn)樣，每次10 μl，測(cè)得黃芩苷和黃芩素峰面積的RSD分別為0.7%和0.9%（n=7），表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

分別精密稱(chēng)取同一供試品（批號(hào)：110101）5份，按“2.2.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，測(cè)量黃芩苷和黃芩素平均含量分別為76.04 mg/g和5.76 mg/g，RSD分別為0.9%和1.0%（n=5），表明本方法重復(fù)性較好。

2.7 回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的樣品（批號(hào)：110101，平均裝量為0.395 4 g）約0.12 g，共6份，分別置100 ml容量瓶中，超聲30 min，放置室溫，用70%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密吸取2 ml置10 ml容量瓶中，分別精密加入對(duì)照品溶液：黃芩苷對(duì)照溶液（231.8 μg/ml）和黃芩素（17.48 μg/ml）各1.0、1.0、1.0、1.0、1.0、1.0 ml，加甲醇稀釋至刻度，用微孔濾膜濾過(guò)，進(jìn)樣10 μl，結(jié)果黃芩苷平均回收率為99.21%，RSD為0.5%（n=6），黃芩素平均回收率為99.12%，RSD為0.6%（n=6）。見(jiàn)表1。

2.8 樣品含量測(cè)定

取本品10片，精密稱(chēng)定，研細(xì)，按“2.2.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，每一批號(hào)的供試品平行制備3份。按上述色譜條件進(jìn)樣，按峰面積外標(biāo)法測(cè)定含量。見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

文獻(xiàn)[5]報(bào)道了檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm，本試驗(yàn)結(jié)果也表明在277 nm處黃芩苷和黃芩素分離效果好，能夠滿(mǎn)足試驗(yàn)要求，故將測(cè)定波長(zhǎng)確定為277 nm。

3.2 色譜條件的考察

采用梯度洗脫，既能縮短分離時(shí)間，又能提高分離效果，采用150 mm短柱，黃芩素與相鄰雜質(zhì)峰分離不好，故選用250 mm的長(zhǎng)柱，流動(dòng)相分別先后考察了磷酸溶液-乙腈、磷酸溶液-甲醇的梯度洗脫，結(jié)果表明，采用磷酸溶液-甲醇的梯度洗脫分離效果好。

3.3 提取方法的考察

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，先后采用了不同濃度的甲醇、不同濃度的乙醇超聲30 min提取，結(jié)果表明70%乙醇超聲30 min提取效率高，又比較了70%乙醇加熱回流3 h提取與超聲30 min的提取效果，結(jié)果表明，加熱回流與超聲提取無(wú)明顯差異，最終選用70%乙醇超聲30 min提取。

3.4 可用于定性鑒別

漢黃芩素也是黃芩的主要成分之一，本法也能實(shí)現(xiàn)漢黃芩素和雜質(zhì)峰的有效分離，漢黃芩素的保留時(shí)間約為29 min。由于所收集的樣品中漢黃芩素的含量低，測(cè)得的峰面積較小，未能實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，但可用于定性鑒別。

[參考文獻(xiàn)]

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品標(biāo)準(zhǔn)(新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn))[S].24冊(cè).2002:844.

[2]南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典(下冊(cè))[M].2版.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,2006:2806.

[3]王君耀,劉放.RP-HPLC測(cè)定雙黃連膠囊中黃芩苷含量[J].中成藥,2003,25(10):附3-4.

[4]李建華,王力生,鄒節(jié)明.水提工藝中黃芩內(nèi)源酶降解黃芩苷的研究[J].中草藥,2009,40(3):397-400.

[5]陳立柱,趙懷清.HPLC法同時(shí)測(cè)定消炎片中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,28(6):448-452.

（收稿日期：2011-09-02）