菠蘿莖蛋白酶的純化及酶活力受超聲處理影響的機(jī)理

陳小麗， 黃卓烈

（1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510642）

菠蘿莖蛋白酶的純化及酶活力受超聲處理影響的機(jī)理

陳小麗1，2， 黃卓烈＊2

（1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510642）

對(duì)菠蘿莖蛋白酶進(jìn)行純化和鑒定，并研究酶活力受超聲處理影響的機(jī)理。采用羧甲基纖維素柱層析純化、PAGE鑒定純度，測(cè)定純化的酶經(jīng)超聲波處理后的酶活性、動(dòng)力學(xué)參數(shù)以及紫外和熒光光譜。柱層析分離出3個(gè)蛋白峰區(qū)域，其中第二蛋白峰經(jīng)電泳鑒定純度較高。酶經(jīng)超聲處理后Km變小，Vm也減?。蛔贤馕展庾V不變，而差示光譜出現(xiàn)了明顯的正峰和負(fù)峰，熒光發(fā)射光譜基本不變。羧甲基纖維素柱層析對(duì)菠蘿莖蛋白酶純化效果較好，超聲處理可能通過(guò)改變菠蘿莖蛋白酶的構(gòu)象從而改變酶活力。

菠蘿莖蛋白酶；純化；酶活力；超聲波；構(gòu)象

菠蘿莖蛋白酶（Stem bromelain，EC 3.4.22.32）是來(lái)源于菠蘿莖的菠蘿蛋白酶（Bromelain），廣泛應(yīng)用于制革、食品、飲料、醫(yī)藥等行業(yè)［1－4］。它是一類(lèi)糖蛋白，至少含有6個(gè)蛋白酶組分［5－7］。由于組分較多，在生產(chǎn)和研究中對(duì)其進(jìn)行純化尤為重要。本試驗(yàn)即采用陽(yáng)離子交換層析法分離純化、陰極電泳鑒定菠蘿莖蛋白酶，并通過(guò)對(duì)酶活力、動(dòng)力學(xué)參數(shù)及光譜特性的研究，探討了酶受超聲處理影響的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

菠蘿莖蛋白酶、酪蛋白（Casein）為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；考馬斯亮藍(lán)G250、R250（Coomassie brilliant blue G250、R250）是從Fluka公司進(jìn)口的生化試劑；羧甲基纖維素（Carboxymethyl cellulose）、聚乙二醇10 000（Polyethylene glycol）、丙烯酰胺（Acrylamide）、N，N＇－甲叉雙丙烯酰胺（N，N＇－Methylenebis－acrylamide）、TEMED 原液，為進(jìn)口分裝試劑。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

北京凱奧科技發(fā)展有限公司752型紫外光柵分光光度計(jì)；上海滬西分析儀器廠生產(chǎn)的BS－100A自動(dòng)部分收集器、HL－2恒流泵、TH－梯度混合器；2.4 cm×30 cm層析柱；北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY－Ⅲ型電泳槽、DYY－5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀；H66025超聲波發(fā)生儀，無(wú)錫市超聲電子設(shè)備廠產(chǎn)品；HWS24型電熱恒溫水浴鍋：上海合恒儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；日本島津UV－2401PC紫外分光光度計(jì)；日本日立F－4500熒光分光光度計(jì)。

1.3 測(cè)定方法

在酶的分離和純化中，柱層析參考前人［5，8－9］分離菠蘿莖蛋白酶的方法，聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）參考何忠效［10］的方法。以酪蛋白為底物測(cè)定菠蘿蛋白酶的酶活性，酶活力單位定義為：1 min內(nèi)每毫克蛋白質(zhì)產(chǎn)生酪氨酸的μg數(shù)（μg／mg·min）表示。蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定參照Bradford［11］的方法，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠蘿莖蛋白酶的純化結(jié)果與鑒定

菠蘿莖蛋白酶用羧甲基纖維素經(jīng)梯度洗脫后分離出3條單獨(dú)的蛋白峰區(qū)域（見(jiàn)圖1A），其中第二蛋白峰的蛋白質(zhì)含量最高，經(jīng)檢測(cè)3個(gè)蛋白峰均有酶活力，且酶活力峰與蛋白峰基本吻合。3種成分應(yīng)為菠蘿莖蛋白酶的同工酶，可選取其中一種成分進(jìn)行深入研究。將柱層析得到的第二蛋白峰中酶活力最高的一支管酶液濃縮后進(jìn)行PAGE，電泳圖譜（見(jiàn)圖1B）顯示酶純度較高。

圖1A 菠蘿莖蛋白酶CM－纖維素層析圖譜Fig.1A CM－cellulose chromatography figure of stem bromelain

圖1B 菠蘿莖蛋白酶PAGE圖譜Fig.1B PAGE figure of stem bromelain

2.2 超聲波對(duì)菠蘿莖蛋白酶催化作用的影響

菠蘿莖蛋白酶經(jīng)過(guò)25W、不同頻率的超聲波處理5 min后，酶活力均有提高（見(jiàn)表1）；采用新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，結(jié)果見(jiàn)表1。該酶經(jīng)過(guò)16.5 k Hz、不同功率的超聲波處理5 min后（見(jiàn)表2），或經(jīng)過(guò)16.5 k Hz、20W的超聲波處理不同時(shí)間后（見(jiàn)表3），酶活力均有提高。故激活菠蘿莖蛋白酶的最佳超聲波參數(shù)組合為：頻率16.5 k Hz，功率20W，處理時(shí)間5 min。

表1 25 W不同頻率超聲波處理菠蘿莖蛋白酶5 min效果Tab.1 Effect of treatment of ultrasound on stem bromelain with 25W、5 minutes and different frequency

表2 16.5 k Hz不同功率超聲波處理菠蘿莖蛋白酶5分鐘效果Tab.2 Effect of treatment of ultrasound on stem bromelain with 16.5 k Hz、different power and 5 minutes

表3 16.5 k Hz、20 W超聲波對(duì)菠蘿莖蛋白酶處理不同時(shí)間效果Tab.3 Effect of treatment of ultrasound on stem bromelain with 16.5 k Hz、20 W and different time

2.3 菠蘿莖蛋白酶動(dòng)力學(xué)研究

用雙倒數(shù)作圖方法（見(jiàn)圖2A）求得菠蘿莖蛋白酶純酶Km值為36.94（mg／m L），Vm值為7.22×103（μg／mg·min）（37℃，p H7.0）；經(jīng)適宜的超聲波處理后酶的Km值為9.18（mg／m L），Vm值為2.46×103（μg／mg·min）（37℃，p H7.0）（見(jiàn)圖2B）。即超聲處理后菠蘿莖蛋白酶的Km變小，比對(duì)照下降了3.02倍；而Vm也變小，比對(duì)照下降了1.93倍。

圖2A 菠蘿莖蛋白酶催化反應(yīng)雙倒數(shù)曲線圖譜Fig.2A Lineweaver－Burk chart of stem bromelain

圖2B 菠蘿莖蛋白酶超聲波處理后催化反應(yīng)雙倒數(shù)曲線圖譜Fig.2B Lineweaver－Burk chart of stem bromelain after ultrasound treatment

2.4 菠蘿莖蛋白酶的光譜研究

紫外吸收光譜：天然菠蘿莖蛋白酶純酶有兩個(gè)明顯的紫外吸收峰（見(jiàn)圖3A），分別在279.2 nm、231.6 nm 處?？梢酝茰y(cè)，酶分子中含酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）和苯丙氨酸（Phe），其中 Tyr和Trp吸收強(qiáng)度很大，而Phe只有微弱吸收。經(jīng)適宜參數(shù)（16.5 k Hz、20 W）超聲波處理5 min后，菠蘿莖蛋白酶兩個(gè)紫外吸收峰分別出現(xiàn)在278.6、231.2 nm（圖3B），即超聲波處理后酶的紫外吸收峰基本沒(méi)有變化，只是吸光值均略有增加。

圖3A 菠蘿莖蛋白酶紫外吸收光譜Fig.3A Ultraviolet absorption spectrum of stem bromelain

圖3B 16.5 k Hz、20 W超聲波處理菠蘿莖蛋白酶紫外吸收光譜Fig.3B Ultraviolet absorption spectrum of stem bromelain after ultrasound treatment

紫外差示光譜：菠蘿莖蛋白酶經(jīng)16.5 k Hz、20 W的超聲波處理5 min后，其紫外差示光譜表明（見(jiàn)圖4A），在262 nm處出現(xiàn)一正峰，在236.8 nm處出現(xiàn)一負(fù)峰。另外，在190～221 nm范圍內(nèi)有大量的正峰出現(xiàn)，且差示吸收值較大。

圖4A 16.5 k Hz、20 W超聲波處理菠蘿莖蛋白酶紫外差示光譜Fig.4A Ultraviolet different spectum of stem bromelain after ultrasound treatment

將用適宜的參數(shù)超聲波處理后的酶放置10 min后，在257、234 nm處出現(xiàn)2個(gè)正峰；放置20、30、40、50、60 min時(shí)，酶均出現(xiàn)兩個(gè)正峰，其中一個(gè)峰值分別位于 257.2、257.4、257.4、257.2、257.2 nm，且隨著放置時(shí)間增加差示吸收值逐漸增大，放置40 min以上后變化逐漸減小，趨于穩(wěn)定；另一個(gè)峰值分別位于234、233、231.6、233.2、230.6、233.4 nm，除放置50 min時(shí)的差示吸收增大外，其它時(shí)間差示吸收值基本不變（見(jiàn)圖4B）。

圖4B 16.5 k Hz、20 W超聲波處理菠蘿莖蛋白酶后放置10－60min紫外差示圖譜Fig.4B Ultraviolet different spectum of stem bromelain after ultrasound treatment and lain 10 to 60 minutes

熒光光譜：天然菠蘿莖蛋白酶有兩個(gè)熒光發(fā)射峰（圖5A），分別位于344.6、559.8 nm（此峰值很小，在本圖中因縱坐標(biāo)較大，故此峰峰形不明顯）處。因游離Trp、Tyr熒光發(fā)射峰分別位于348、303 nm，故第一個(gè)發(fā)射峰（344.6 nm）由Trp和Tyr共同作用引起，而由于Trp的存在，Tyr的發(fā)射光譜未表現(xiàn)出來(lái)；由于第二發(fā)射峰（559.8 nm）熒光值很小，且經(jīng)鑒定與背景溶液的發(fā)射峰吻合，故認(rèn)為是由背景溶液中激活劑與酶分子相互作用引起，不是酶分子的特征發(fā)射峰。

圖5A 菠蘿莖蛋白酶熒光發(fā)射光譜Fig.5A Fluorescence spectum of stem bromelain

經(jīng)超聲波處理后酶的熒光發(fā)射峰略有紅移（見(jiàn)圖5B），位于346.8 nm，熒光值降低；但是發(fā)射波長(zhǎng)只改變約2 nm，沒(méi)有較大的改變，因而不是酶分子構(gòu)型改變引起的。天然酶中存在的第二發(fā)射峰經(jīng)超聲處理后消失。處理后的酶放置10 min后，熒光發(fā)射峰開(kāi)始由346.8 nm向低波長(zhǎng)移動(dòng)，位于345.2 nm，熒光值繼續(xù)降低；放置20 min后，熒光發(fā)射峰繼續(xù)向低波長(zhǎng)移動(dòng)，恢復(fù)到天然酶發(fā)射峰，即位于344.6 nm，熒光值則升高，接近天然酶熒光值（見(jiàn)圖5B）。

圖5B 超聲波處理后放置0、10、20 min菠蘿莖蛋白酶熒光發(fā)射光譜Fig.5B Fluorescence spectum of stem bromelain after ultrasound treatment and lain 0，10 and 20 minutes

3 結(jié)語(yǔ)

菠蘿莖蛋白酶是一類(lèi)堿性蛋白質(zhì)，pI約為9.55；雖然 T L Mynott et al［12］采用p H 5.0的乙酸緩沖液在S－Sepharose上快速高效液相層析將菠蘿蛋白酶純化得到約15 070、25 850和27 450相對(duì)分子質(zhì)量并具有等電點(diǎn)10.4和10.45的蛋白，并申請(qǐng)了專(zhuān)利，但研究發(fā)現(xiàn)采用陰離子交換劑進(jìn)行柱層析分離效果欠佳，而文獻(xiàn)［7，13－14］中也多采用陽(yáng)離子交換劑進(jìn)行純化，都得到了3～5種較單一的組分。故本研究采用陽(yáng)離子交換劑羧甲基纖維素進(jìn)行分離，得到了3個(gè)均具有酶活力的蛋白峰，其中酶活最高的蛋白峰經(jīng)電泳鑒定表明為單一條帶，分離效較好果。由于等電點(diǎn)高，采用一般的陽(yáng)極電泳時(shí)該酶在相應(yīng)緩沖系統(tǒng)中解離的離子不泳動(dòng)，所以本研究在柱層析后采用陰極電泳鑒定純度，效果較好。

經(jīng)超聲波處理后，菠蘿莖蛋白酶Km減小，而Vm也減小。Km變小，說(shuō)明酶與底物的親和力變大；而Vm也變小，可能是由于超聲處理后的酶構(gòu)象發(fā)生變化，雖然由于與底物親和力增大酶很快被飽和，但酶與底物復(fù)合物不能迅速分解為產(chǎn)物，反應(yīng)速度不能隨著底物濃度的增加而增大，而且在高底物濃度時(shí)活力被抑制。在兩種情況中，酶與底物親和力增大是超聲波處理后酶活力增大的主要影響因素。

一般認(rèn)為在230 nm波長(zhǎng)以下的紫外吸收光譜的變化反映酶蛋白主鏈構(gòu)型的變化；240～300 nm波長(zhǎng)內(nèi)紫外吸收光譜的變化主要是Trp、Tyr和Phe的作用。紫外光譜的研究表明，超聲波處理后，菠蘿莖蛋白酶的紫外吸收光譜與對(duì)照比較并沒(méi)有多少改變，因而其分子構(gòu)型并沒(méi)有發(fā)生變化，分子的各種共價(jià)鍵依然保持原來(lái)的結(jié)構(gòu)；而處理后紫外差示光譜出現(xiàn)了明顯的正峰和負(fù)峰，因Phe的苯基在261 nm處有吸收峰，而Tyr的酚基和半胱氨酸（Cys）殘基在235 nm處有一吸收峰，表明酶的構(gòu)象發(fā)生了變化，從而使Phe、Tyr和Cys所處的微環(huán)境改變，出現(xiàn)明顯的差吸收峰。另外，在190～221 nm范圍內(nèi)有大量的正峰出現(xiàn)，且差示吸收值較大，表明酶分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，可能是主鏈上大量基團(tuán)暴露，出現(xiàn)大量正峰。處理后的酶放置10 min時(shí)的光譜特征說(shuō)明，在超聲波處理后，酶的構(gòu)象仍在變化，有可能是超聲波處理時(shí)傳遞給酶的能量在放置一段時(shí)間后逐漸消失，生色氨基酸殘基微環(huán)境逐漸復(fù)原。放置至60 min，差吸收峰基本不變，但257 nm處的吸收強(qiáng)度逐漸增大，可能是因?yàn)镻he已經(jīng)完全暴露出來(lái)；而234 nm附近的吸收峰強(qiáng)度變化不大，說(shuō)明Tyr或Cys微環(huán)境放置10 min以上后不再變化。

蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光來(lái)自芳香族氨基酸。Trp殘基，Tyr殘基和Phe殘基由于其發(fā)色團(tuán)（側(cè)鏈基團(tuán)）不同，而有不同的熒光光譜，其最大熒光強(qiáng)度的波長(zhǎng)分別是348、303和282 nm［15］。熒光光譜的研究進(jìn)一步揭示了超聲處理后菠蘿莖蛋白酶的構(gòu)型與構(gòu)象的關(guān)系。處理后酶分子的熒光發(fā)射峰的波長(zhǎng)雖然稍有改變，但并沒(méi)有太大的變化，而處理前后的差別主要是發(fā)射強(qiáng)度的改變。這些進(jìn)一步說(shuō)明超聲波處理后酶分子的構(gòu)型沒(méi)有變化，但分子的構(gòu)象確實(shí)改變了。主要表現(xiàn)為芳香族氨基酸熒光強(qiáng)度改變。文獻(xiàn)［16］曾經(jīng)報(bào)道，菠蘿莖蛋白酶包含5個(gè)Trp殘基，大量序列與木瓜蛋白酶同源表明3個(gè)埋在疏水核內(nèi)，而另兩個(gè)位于分子表面。菠蘿莖蛋白酶經(jīng)超聲波處理后，熒光值降低；說(shuō)明Trp所處的微環(huán)境極性增大，可能的原因是超聲作用改變酶的構(gòu)象，使原本處于分子內(nèi)部疏水環(huán)境中的Trp暴露到分子表面。天然酶中存在的第二發(fā)射峰消失，可能是超聲處理使酶的構(gòu)象發(fā)生了變化，影響激活劑與酶之間的互作，使熒光熄滅。超聲處理后的酶放置一段時(shí)間后，Trp所處的微環(huán)境極性逐漸變小，酶分子構(gòu)象逐漸恢復(fù)到天然狀態(tài)。由此進(jìn)一步說(shuō)明，超聲波處理改變菠蘿莖蛋白酶活力不是改變酶分子構(gòu)型，而是使分子構(gòu)象改變，從而導(dǎo)致酶活力的改變。

（References）：

［1］Ilaria Benucci，Katia Liburdi，Anna Maria Vittoria Garzillo，et al.Bromelain from pineapple stem in alcoholic－acidic buffers for wine application［J］.Food Chemistry，2011，124（4）：1349－1353.

［2］Katya Chobotova，Ann B.Vernallis，F(xiàn)adzilah Adibah Abdul Majid.Bromelain＇s activity and potential as an anti－cancer agent：Current evidence and perspectives［J］.Cancer Letters，2010，290（2）：148－156.

［3］Jane E.Onken，Paula K.Greer，Brian Calingaert，et al.Bromelain treatment decreases secretion of pro－inflammatory cytokines and chemokines by colon biopsiesin vitro［J］.Clinical Immunology，2008，126（3）：345－352.

［4］David J.Fitzhugh，Siqing Shan，Mark W.Dewhirst，et al.Bromelain treatment decreases neutrophil migration to sites of inflammation［J］.Clinical Immunology，2008，128（1）：66－74.

［5］Murachi T，Yasui M，Yasuda Y.Purification and physical characterization of stem bromelain［J］.Biochemistry，1964，3（1）：48－55.

［6］Ota S，Moore S，Stein W.H.Preparation and chemical properties of purified stem and fruit bromelains［J］.Biochemistry，1964，3（2）：180－185.

［7］Ota S，Muta E，Katahira Y，et al.Reinvestigation of fractionation and some properties of the proteolytically active components of stem and fruit bromelain［J］.J Biochem，1985，98：219－228.

［8］Arroyo－Reyna A，Hernandez－Arana A，Arreguin－Espinosa R.Circular dichroism of stem bromelain：a third spectral class within the family of cysteine proteinases［J］.J Biochem，1994，300：107－110.

［9］Devakate R V，Patil V V，Waje S S，et al.Purification and drying of bromelain［J］.Separation and Purification Technology，2009，64（3）：259－264.

［10］何忠效，張樹(shù)政.電泳［M］.北京：科學(xué)出版社，1999.

［11］Bradford R M.Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding［J］.Anal Biochem，1976，72：248－254.

［12］Cortecs（UK）Ltd.Component of bromelain［P］.中國(guó)：CN1252096A（C12N9／50）

［13］Rowan AD，Buttle DJ，Barrett AJ.Ananain：a novel cysteine proteinase found in pineapple stem［J］.Arch Bichen Biophys，1988，267：262－270.

［14］Harrach T，Eckert K，Maurer HP，et al.Isolation and charac terization of two forms of an acidic bromelain stem proteinases［J］.J Protein Chem，1998，17（4）：351－361.

［15］陶慰孫，李惟，姜涌明.蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)［M］.北京：高等教育出版社.2003.

［16］Haq S K，Rasheedi S，Khan R H.Characterization of a partially folded intermediate of stem bromelain at low pH［J］.Eur.J.Biochem，2002，269：47－52.

Purification of Stem Bromelain and Mechanism of Effect of Ultrasound on Its Catalysis Activity

CHEN Xiao－li1，2，HUANG Zhuo－lie＊2

（1.College of Fisheries，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088；2.College of Life Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642）

To purify and identify stem bromelain for further study on its activity and mechanism after treated with ultrasound.Stem bromelain was purified and identified with carboxymethyl cellulose chromatography and polyacrylamide gel electrophoresis（PAGE）respectively.Enzyme activity，kinetic parameter，ultraviolet spectrum and fluorescence spectrum were studied on purified enzyme treated with ultrasound.Three single protein apex regions were separated with gradient elution.The ingredient with the highest activity in the second protein apex region was identified with PAGE，showing considerably high purity.After treatment with ultrasound，bothKmandVmdecreased.No clear changes were observed in the ultraviolet absorption spectrum and the fluorescence emission spectrum while positive and negative peaks occurred in the differential ultraviolet spectrum.Conclusion：Considerably pure component of stem bromelain can be obtained after purified with carboxymethyl cellulose chromatography .It＇s probably conformation change that results activity change after treatment of the ultrasound on stem bromelain.

stem bromelain，purification，enzyme activity，ultrasound，conformation

＊通信作者：黃卓烈（1950－），男，廣東人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物等方面的研究。zhuolieh＠scau.edu.cn

TQ 925.2

A

1673－1689（2012）05－0473－06

2011－04－27

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（10074016和10174021）。

陳小麗（1978－），女，湖北人，博士研究生，講師，主要從事生物化學(xué)方面的研究。chenxl89＠gdou.edu.cn