Reg Ⅳ蛋白在結(jié)腸癌組織中表達(dá)及與其發(fā)生發(fā)展的關(guān)系

鄭聲琴 何 杰 鄭 勤 張全安

結(jié)腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)生具有多階段、多因素的特征，在此過(guò)程中涉及癌基因的突變和活化、抑癌基因的丟失或表達(dá)失調(diào)以及凋亡調(diào)節(jié)機(jī)制紊亂等遺傳學(xué)改變[1，2]。再生基因 Ⅳ (regenerating gene Ⅳ,Reg Ⅳ) 是新發(fā)現(xiàn)的1個(gè)癌基因，其有可能參與腫瘤尤其是消化道腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。基因表達(dá)的序列分析 (serial analysis of gene expressi on,SAGE) 結(jié)果得到： Reg Ⅳ在結(jié)腸正常黏膜、結(jié)腸腺癌、 胰腺癌、 胃癌和前列腺癌中均表達(dá)，尤其在結(jié)直腸腺瘤癌變區(qū)其轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)特別明顯，但是在結(jié)腸正常黏膜 Reg Ⅳ 基因呈低表達(dá)[3]。通過(guò) SAGE表達(dá)譜分析認(rèn)為，Reg Ⅳ基因可能是消化系統(tǒng)癌微轉(zhuǎn)移的特異性標(biāo)記物[4]，其表達(dá)上調(diào)可能與預(yù)后不良有關(guān)。我們采用免疫組織化學(xué)法,檢測(cè)Reg Ⅳ蛋白在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況，旨在探討Reg Ⅳ在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取我院病理科 2008年～2010 年收集的102例結(jié)腸癌石蠟標(biāo)本 (均取自腫瘤原發(fā)灶，均經(jīng)病理檢查確診)。其中男性 70例，女性32例，年齡 31～75 (51± 30) 歲，術(shù)前均未行放療和化療。50例正常結(jié)腸黏膜組織術(shù)中取出經(jīng)4%多聚甲醛固定后制成石蠟標(biāo)本。免疫 Reg Ⅳ蛋白多克隆抗體為Santa cruz產(chǎn)品，稀釋度為 1∶200； SABC免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京天根有限公司。

1.2 方法

結(jié)腸癌標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片 (厚度 4 pm)，其中一片用于常規(guī)HE 染色，其余用于免疫組織化學(xué)。石蠟切片經(jīng)脫蠟水化后入PBS (pH7.4)，經(jīng)甲醇- H2O2，室溫孵育20 min，除去內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，蒸餾水洗3遍；微波修復(fù)抗原，滴加抗原修復(fù)液室溫 10 min，甩去血清后滴加1 ∶200 Reg Ⅳ多抗，4℃ 過(guò)夜，0.5 mol/L PBS洗2 min 3 次；滴加生物素化羊抗兔IgG， 37℃、20 min，O- SM PBS 洗 5 min 4 次；經(jīng)DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，脫水、透明、封片。正常結(jié)腸組織對(duì)照用PBS代替一抗。

1.3 觀察指標(biāo)

采用Olympus光學(xué)顯微鏡觀察，胞質(zhì)或胞膜呈棕色、棕褐色者為陽(yáng)性細(xì)胞。顯微鏡下觀察 Reg Ⅳ表達(dá)強(qiáng)度， 標(biāo)準(zhǔn)為：0～5個(gè)腫瘤細(xì)胞染色記為0分；6 ～20個(gè)腫瘤細(xì)胞染色為1分；21～50個(gè)腫瘤細(xì)胞染色為2分；50個(gè)以上腫瘤細(xì)胞染色為3分。0分為陰性， 1～3 分為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 Reg Ⅳ在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，50例正常結(jié)腸黏膜上皮中無(wú)Reg Ⅳ 表達(dá)，而102例結(jié)腸癌組織中35例 (34.31%) 呈陽(yáng)性表達(dá)，兩組比較差異有顯著性 (P<0.05)。

2.2 Reg Ⅳ表達(dá)與結(jié)腸癌病理分級(jí)和臨床分期的關(guān)系

G1級(jí)結(jié)腸癌組織與G3級(jí)比較，Reg Ⅳ陽(yáng)性表達(dá)率明顯增高，差異有顯著性，P<0.05。T0～T4期結(jié)腸癌組織中Reg Ⅳ陽(yáng)性率分別為0、33.33%、44.44%、52.38%和71.42%，差異均有顯著性(P<0.05)；與T0期比較，T4期染色體分值明顯增加，P<0.05，見(jiàn)表1。對(duì)Reg Ⅳ表達(dá)陽(yáng)性率與結(jié)腸癌臨床分期做回歸分析，見(jiàn)圖1，回歸方程為 γ=5.955+15.83X，為直線回歸，相關(guān)系數(shù) γ=0.973，表明 Reg Ⅳ表達(dá)強(qiáng)度與結(jié)腸癌臨床分期呈線性關(guān)系。

3 討論

Reg家族是一群主要在肝、胰和胃腸道中發(fā)揮作用的小分子、多功能的分泌性蛋白,與組織損傷、炎癥、糖尿病和腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。2001年Hartupee等[5]從炎癥性腸病庫(kù)中篩選出再生基因4 (regenerating islet-derived family,member 4,RegⅣ)，其定位于1p12-13.1，RegⅣ蛋白由158個(gè)氨基酸組成。 RegⅣ選擇性表達(dá)于正常胰腺和胃腸道上皮,炎癥或腫瘤組織中其表達(dá)明顯增強(qiáng)， 提示RegⅣ與消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展可能關(guān)系密切。

表1 Reg Ⅳ表達(dá)與結(jié)腸癌組織臨床病理特征的關(guān)系(例)

注： ①為與 G1相比，P<0.05；②為與T0相比，P<0.05；③為與T1相比，P<0.05

圖1 Reg Ⅳ表達(dá)與結(jié)腸癌臨床分期的相關(guān)性

Oue 等[6]發(fā)現(xiàn)雖然RegⅣ在結(jié)直腸癌 (colorectal cancer，CRC) 的表達(dá)比正常結(jié)腸組織高。36.1% (13/36) 結(jié)腸直腸腺癌是RegⅣ陽(yáng)性，并與腫瘤分期有關(guān)。93.3% (14/15) 結(jié)腸直腸類(lèi)癌瘤檢測(cè)到RegⅣ表達(dá)。有學(xué)者[7]應(yīng)用RT-QPCR和膜芯片技術(shù)，研究CRC患者外周血中RegⅣ等6種mRNA標(biāo)志物的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RegⅣ mRNA過(guò)表達(dá)率為80.0% (64/80)，RegⅣ mRNA過(guò)表達(dá)與CRC TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。CRC伴肝轉(zhuǎn)移者RegⅣ表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于無(wú)轉(zhuǎn)移病例。 RegⅣ陽(yáng)性表達(dá)CRC比陰性表達(dá)存活率低 。ELISA法檢測(cè)CRC患者術(shù)前血清RegⅣ水平顯示Ⅳ期CRC伴肝轉(zhuǎn)移患者較0～Ⅲ期患者明顯升高，說(shuō)明RegⅣ是預(yù)后不良的預(yù)測(cè)因子,血清RegⅣ濃度可能預(yù)測(cè)CRC并發(fā)肝轉(zhuǎn)移。Violette 等[8]應(yīng)用差異展示PCR法，分析發(fā)現(xiàn)RegⅣ在CRC耐藥細(xì)胞中高表達(dá),在敏感細(xì)胞系則是低表達(dá),提示RegⅣ在CRC中的潛在作用,而且可能是影響腫瘤患者存活率的預(yù)后指標(biāo)并與腫瘤的耐藥性有關(guān)。

Oue 等[7]發(fā)現(xiàn)29.4%的胃癌RegⅣ呈陽(yáng)性表達(dá),并與小腸黏蛋白表型和神經(jīng)內(nèi)分泌分化有關(guān)。定量RT-PCR分析顯示RegⅣ在30.4%的胃癌組織中呈高水平表達(dá)，而在正常胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸、胰腺都呈低水平表達(dá)。Sentani 等[9]對(duì)多種組織印戒細(xì)胞癌 (signet-ring cell carcinoma,SRCC) 進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)RegⅣ染色有助于胃腸道SRCC的診斷。Takehara 等[10]報(bào)道RegⅣ在胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。 RegⅣ蛋白呈時(shí)間劑量依賴(lài)性促進(jìn)PDAC細(xì)胞的生長(zhǎng)，通過(guò)RNA干擾技術(shù)可阻斷RegⅣ的促生長(zhǎng)效應(yīng),同時(shí)外源性RegⅣ蛋白促進(jìn)PK-45P細(xì)胞的Akt的磷酸化， 提示RegⅣ的促生長(zhǎng)效應(yīng)可能通過(guò)PKB/Akt信號(hào)通路來(lái)介導(dǎo)， 以抗體中和RegⅣ效應(yīng)可能是一潛在的治療PDAC的工具。早期PDAC患者血清中呈現(xiàn)RegⅣ水平的顯著提高， 血清RegⅣ可能是檢測(cè)早期PDAC的腫瘤標(biāo)志物。然而， RegⅣ在CRC、 GC、炎癥性腸病、闌尾黏液囊腺瘤和腹膜假性黏液瘤 (pseudomyxoma peritonei,PMP)、前列腺癌和唾液腺囊性腺樣癌中高表達(dá),所以血清中RegⅣ水平的升高在診斷中的靈敏度和特異度還要大量基礎(chǔ)研究的證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Reg Ⅳ在結(jié)腸癌中的表達(dá)明顯高于正常結(jié)腸組織 ；在結(jié)腸癌細(xì)胞中 G1、G2和G3級(jí)表達(dá)分別為 0 、22.22%和68.66%，與G1相比，G3級(jí)染色分值明顯增加，兩者間比較，差異有顯著性。結(jié)果表明，Reg Ⅳ與結(jié)腸癌分化密切相關(guān)，分化程度越低，其表達(dá)越高，提示Reg Ⅳ有可能是結(jié)腸癌病理分級(jí)診斷的輔助指標(biāo)，通過(guò)研究?jī)烧呦嚓P(guān)性我們發(fā)現(xiàn)兩者呈線性關(guān)系，這也表明Reg Ⅳ表達(dá)水平隨結(jié)腸癌侵襲力增強(qiáng)而增高。Reg Ⅳ有望作為1種有價(jià)值的生物標(biāo)志物來(lái)評(píng)估結(jié)腸癌的惡性程度，對(duì)治療方案的選擇和術(shù)后隨訪提供指導(dǎo)，提示Reg Ⅳ與結(jié)腸癌的發(fā)生及演變過(guò)程密切相關(guān)，對(duì)結(jié)腸癌行Reg Ⅳ蛋白的檢測(cè)有可能作為臨床判斷結(jié)腸癌生物學(xué)行為浸潤(rùn)深度的一項(xiàng)重要指標(biāo)，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。谷化平等[11]研究認(rèn)為VEGF、EGFR和PTEN與結(jié)腸癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為判斷結(jié)腸癌預(yù)后的指標(biāo)，而VEGF和EGFR是目前臨床應(yīng)用較廣的檢測(cè)指標(biāo)，Reg Ⅳ的作用是否與VEGF、EGFR相關(guān)，可能是我們下一步研究的內(nèi)容之一。

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