HER2基因在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

劉姍姍 彭忠異 文亦磊 崔錦珠 王進(jìn)聲 張錫流

近年來研究表明，細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖信號(hào)的過度刺激及細(xì)胞凋亡的抑制等可以打破細(xì)胞增殖生長(zhǎng)和死亡清除之間的平衡，進(jìn)而可以引起腫瘤的發(fā)生。內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(HER-2)是1種磷酸化受體蛋白,其在腫瘤中的過度表達(dá),最終影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。目前，有關(guān)HER-2在胃癌組織中表達(dá)的研究報(bào)道甚少，有關(guān)應(yīng)用熒光原位雜交(FISH技術(shù))結(jié)合傳統(tǒng)HE染色及免疫組化(IHC技術(shù))檢測(cè)胃癌標(biāo)本HER-2擴(kuò)增及HER-2表達(dá)情況的報(bào)道更是罕見。我們應(yīng)用FISH技術(shù)及IHC技術(shù)，檢測(cè)HER-2擴(kuò)增及HER-2基因表達(dá)情況；探討HER-2基因表達(dá)、擴(kuò)增與胃癌生物學(xué)行為的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2009年～2011年存檔的胃癌活檢標(biāo)本20例。胃癌患者中，男性13例，女性7例；年齡35～78歲，中位年齡62歲。按WHO國(guó)際組織分類標(biāo)準(zhǔn)：管狀腺癌(高、中分化型)12例，低分化型腺癌6例，未分化型腺癌2例。按國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)臨床TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期12例，Ⅲ～Ⅳ期8例;侵及漿膜層11例，未侵及漿膜層9例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移7例。胃癌患者活檢前均未接受過放化療及其它針對(duì)腫瘤的治療。

1.2 試劑與方法

GLP HER2/CSP 17探針、HER-2 FISH TM檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京金菩嘉生物技術(shù)有限公司；即用型C-erbB-2兔抗人單克隆抗體、免疫組化Envision plus廣譜試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

FISH檢測(cè)方法：采用金菩嘉HER2 DNA FISH探針(標(biāo)記紅色熒光)，設(shè)對(duì)照探針(標(biāo)記綠色熒光),其中主要含DNA FISH探針和雜交緩沖液。標(biāo)本處理：①石蠟切片于65℃烤片過夜，常規(guī)脫蠟至水， 50℃下用30%酸性亞硫酸鈉處理組織切片20～30 min。2×SSC溶液中漂洗5 min×2次。②37℃蛋白酶K工作液中孵育20～30 min，然后在2×SSC溶液中漂洗5 min×2次，0.1M HCl中室溫浸泡5～10 min，再次在2×SSC溶液中漂洗5 min×2次。③脫水：玻片依次置于-20℃預(yù)冷的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各脫水2 min，再室溫浸入丙酮溶液中2 min，自然干燥玻片。FISH技術(shù)：①變性：73℃±1℃的70%甲酰胺變性液中浸泡5 min，然后依次置于預(yù)冷的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中進(jìn)行梯度脫水各3 min。②雜交：10 μl探針混合液滴于玻片組織上,蓋上蓋玻片,橡皮膠封片。73℃變性5 min,42℃雜交過夜。③洗滌：在73℃的2×SSC/0.3% NP40洗脫液中洗滌2 min,再于室溫洗滌5 s,自然干燥。觀察結(jié)果：暗處自然干燥玻片，將15 μl DAPI復(fù)染劑滴加于雜交區(qū)域位置，立即蓋上蓋玻片。暗處放置10～20 min后，熒光顯微鏡下觀察。

免疫組化法(Envision二步法)：石蠟切片于65℃烤片2 h，常規(guī)脫蠟至水，用pH7.4的PBS沖洗3 min×3次。pH6.0檸檬酸鹽緩沖液微波加熱修復(fù)10 min，PBS沖洗3 min×2次。阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性：3% H2O2室溫孵育10 min，PBS沖洗3 min×3次。滴加一抗，室溫孵育2 h。PBS沖洗5 min×3次。滴加聚合物增強(qiáng)劑試劑A，室溫孵育20 min。PBS沖洗3 min×3次。滴加酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物試劑B，室溫孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次。滴加DAB液，顯微鏡下觀察5 min。蘇木精復(fù)染，0.1%HCl分化，自來水沖洗，藍(lán)化，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干后觀察。

1.3 結(jié)果判斷

IHC技術(shù)檢測(cè)HER2蛋白表達(dá)結(jié)果判定[1]：無染色或<10%的細(xì)胞胞膜染色為“-”，>10%的細(xì)胞不完整胞膜染色為“+”，>10%的細(xì)胞有較弱的完整胞膜染色為“++”，>10%的細(xì)胞有較強(qiáng)的完整胞膜染色為“+++”?！?”和“+”視為無或低表達(dá)，“++”和“+++”視為過表達(dá)。FISH技術(shù)檢測(cè)HER2基因擴(kuò)增結(jié)果判定[2]：正常細(xì)胞紅色信號(hào)/綠色信號(hào)為2∶2；異常細(xì)胞紅色信號(hào)>2且綠色信號(hào)≥2。計(jì)數(shù)30個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)Ratio值(Ratio值=同30個(gè)細(xì)胞核中紅/綠)。Ratio<1.8為“-”，無擴(kuò)增；Ratio>2.2為“+”，擴(kuò)增；Ratio在1.8～2.2之間時(shí)，增加計(jì)數(shù)細(xì)胞至100個(gè)加以判斷。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

IHC檢測(cè)20例胃癌組織中HER-2蛋白陽性表達(dá)6例，陽性率為30%；FISH檢測(cè)HER-2基因擴(kuò)增7例，擴(kuò)增率為35%。胃癌組織中HER-2/neu蛋白陽性表達(dá)及HER-2/neu基因擴(kuò)增，均與患者性別、年齡和腫瘤分化程度無顯著相關(guān)性(P>0.05)，而與腫瘤浸潤(rùn)深度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)，結(jié)果見表1、2。

表1 HER2蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例，%)

3 討論

3.1 HER2的檢測(cè)方法及技術(shù)

目前美國(guó)食品及藥物管理局( FDA)批準(zhǔn)用于HER2檢測(cè)的方法有2種:即免疫組化法(IHC)和熒光原位雜交法(FISH)[3]。IHC法是檢測(cè)H ER2基因蛋白水平較常用的1種方法，它能對(duì)HER2癌基因進(jìn)行定位,陽性者的細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒；FISH法為檢測(cè)HER2基因擴(kuò)增的1種方法,用于檢查分裂期細(xì)胞的核型、識(shí)別染色體數(shù)目,確定腫瘤細(xì)胞的來源[4]。

表2 HER2基因擴(kuò)增與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例，%)

IHC和FISH具有需要組織少，可保持原有組織結(jié)構(gòu)并做形態(tài)學(xué)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，這既滿足了對(duì)不同區(qū)域癌組織的研究需要，又避免了樣本中非腫瘤成分的影響，在技術(shù)上IHC和FISH完全可完全標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化。由于IHC實(shí)驗(yàn)修復(fù)過程影響蛋白質(zhì)表達(dá)，因此對(duì)于HER2蛋白表達(dá)的研究,IHC無法避免假陽性。FISH檢測(cè)HER2基因的擴(kuò)增時(shí)，DNA的穩(wěn)定性比蛋白質(zhì)強(qiáng),實(shí)驗(yàn)操作影響較小,且其結(jié)果定量判讀,盡量避免了主觀上的誤差。故本實(shí)驗(yàn)綜合采用IHC和FISH 2種檢測(cè)方法。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在HER2高表達(dá)的乳腺癌標(biāo)本中，IHC與檢測(cè)基因水平的FISH全面符合率達(dá)96%[5]。在本研究中，胃癌HER2的表達(dá)檢測(cè)IHC與FISH全面符合率達(dá)95% ，與上述結(jié)果基本一致。

3.2 HER2與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系

原癌基因HER2又稱c-ebrB-2，屬于表皮生長(zhǎng)因子受體家族，定位于人染色體17q21，編碼1種分子量為185 kD的跨膜蛋白，在正常情況下處于非激活狀態(tài)[6]。HER2受體胞內(nèi)區(qū)有酪氨酸蛋白激酶PTK活性，自身也具有若干酪氨酸殘基Tyr磷酸化位點(diǎn)。特異性生長(zhǎng)因子與HER2受體結(jié)合后可誘導(dǎo)二聚體化并激發(fā)受體的交叉磷酸化，磷酸化的受體可以把細(xì)胞外的生長(zhǎng)信號(hào)迅速轉(zhuǎn)導(dǎo)至核內(nèi)，刺激控制與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因表達(dá)。HER2基因可通過基因突變被激活，且其擴(kuò)增將導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄上調(diào)，蛋白合成增加，從而參與抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF/血管通透性因子VPF，促進(jìn)腫瘤新生血管生成，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲力，破壞機(jī)體抗侵襲屏障等[7]。HER2癌基因擴(kuò)增的產(chǎn)物可以通過不同的信號(hào)傳導(dǎo)通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞無序增殖和惡性轉(zhuǎn)化，HER2蛋白過表達(dá)在細(xì)胞的分裂、增殖、轉(zhuǎn)化、促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲、黏附中也發(fā)揮重要作用[8]。HER2基因擴(kuò)增和(或)蛋白過表達(dá)往往提示腫瘤惡性程度高，轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)。

3.3 HER2表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

目前，有文獻(xiàn)報(bào)道在結(jié)直腸癌中，HER2基因的擴(kuò)增、突變與HER2蛋白表達(dá)有關(guān)[9]。HER2基因擴(kuò)增和蛋白過表達(dá)廣泛存在于乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌、食管癌、結(jié)腸癌和肺癌等惡性腫瘤中[10]。已經(jīng)證實(shí)20%～40%乳腺癌中存在HER2基因的擴(kuò)增及過度表達(dá)，并認(rèn)為HER2基因表達(dá)是乳腺癌獨(dú)立的預(yù)后因素[11]。本研究結(jié)果顯示，在20例胃癌組織中HER2基因擴(kuò)增率為35%，HER2蛋白表達(dá)率為30%，HER2基因擴(kuò)增和蛋白表達(dá)與患者性別、年齡無關(guān)，說明胃癌中HER2表達(dá)無性別、年齡差異；在不同分化程度的胃癌中，HER2蛋白陽性率及基因擴(kuò)增率亦無顯著性差異，揭示了HER2表達(dá)與胃癌細(xì)胞分化程度無顯著相關(guān)性;而侵及漿膜層胃癌中HER2陽性表達(dá)率及基因擴(kuò)增率顯著高于未侵及漿膜層者，提示HER2表達(dá)的胃癌組織局部侵襲性更大;伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌HER2陽性表達(dá)率及基因擴(kuò)增率高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，這表明HER2參與了胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移過程；HER2陽性表達(dá)率及基因擴(kuò)增率胃癌Ⅲ期和Ⅳ期中高于Ⅰ期和Ⅱ期，證明隨著腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，HER2基因表達(dá)也增強(qiáng)，從而進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移，加速了病情的進(jìn)展?？傊?，HER2在胃癌向中晚期發(fā)展、向深部組織浸潤(rùn)、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的過程中起著非常重要的作用。

3.4 HER2檢測(cè)的臨床價(jià)值與意義

近來，能特異性針對(duì)腫瘤靶點(diǎn)，從分子水平阻斷腫瘤惡性生物學(xué)行為，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的分子靶向治療MTT已經(jīng)成為腫瘤研究的熱點(diǎn)[12]。HER2靶向抗體曲妥珠單抗(herceptin,赫賽汀)是1種重組DNA衍生的人源化單克隆抗體，選擇性地作用于HER2的細(xì)胞外部位，通過抑制HER-2 蛋白表達(dá)而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的,適用于治療HER2過度表達(dá)的乳腺癌[13]。NCCN臨床治療指南己將Herceptin列為中高風(fēng)險(xiǎn)早期乳腺癌患者輔助治療及轉(zhuǎn)移性乳腺癌治療的基本用藥。對(duì)于Herceptin在胃癌上的使用因?yàn)镠ER2在胃癌的表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一，故其在胃癌上的使用經(jīng)驗(yàn)不多。Tanner 等[14]報(bào)道HER2靶向抗體對(duì)有HER2基因擴(kuò)增的胃癌和乳腺癌細(xì)胞N87和SKBP-3都一樣有抑制生長(zhǎng)作用，Rebischunge等[15]證實(shí)HER2靶向抗體聯(lián)合化療對(duì)HER2基因過度表達(dá)的轉(zhuǎn)移性胃癌有效。本研究結(jié)果表明，在胃癌中HER2蛋白有較高的陽性表達(dá)率、HER2基因有較高的基因擴(kuò)增率，這就為Herceptin在胃癌的治療提供了理論依據(jù)。

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