胃癌組織中Ezrin和nm-23的表達(dá)及臨床意義

劉換新 彭 娟 陳 娟 梁敏燕

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤，其術(shù)后5年生存率較低，浸潤轉(zhuǎn)移是影響其療效及導(dǎo)致患者死亡的主要原因[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Ezrin蛋白在許多惡性腫瘤如卵巢癌、骨肉瘤、惡性黑色素瘤等中呈高表達(dá)[2,3]，與腫瘤的轉(zhuǎn)移有高度的相關(guān)性[4～6]。nm-23基因是公認(rèn)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，其編碼的蛋白質(zhì)具有維持細(xì)胞正常分裂，并抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的功能[7～10]。Ezrin蛋白在胃癌中的表達(dá)及意義國內(nèi)少見報(bào)道[1]，也有學(xué)者探討了nm-23在胃癌中的表達(dá)[7]，但兩者的相關(guān)性未見報(bào)道。本研究旨在探討胃癌組織中Ezrin和nm-23在胃癌及癌旁組織中表達(dá)情況及兩者相關(guān)性，為胃癌的臨床治療及預(yù)后判斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集武警廣東總隊(duì)醫(yī)院病理科2004年3月～2006年6月胃癌手術(shù)切除標(biāo)本164例，其中男性110例，女性54例；138例為無病生存(Disease-free survival，DFS)小于5年(出現(xiàn)遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移)或已經(jīng)死亡的病例，26例DFS大于5年的病例；年齡最大78歲，最小36歲，中位年齡47.8歲。按WHO2003年胃腫瘤組織學(xué)分類，其中高分化腺癌99例，中分化腺癌41例，低分化腺癌20例，未分化癌4例；pTNM 分期，Ⅰ期6例(3.7%)、Ⅱ期59例(35.9%) 、Ⅲ期55例(33.5%) 、Ⅳ期44 例(26.8%) ；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移108例(65.9%)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移56例(34.1%)。對每1例標(biāo)本經(jīng)常規(guī)HE染色后，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察并做出診斷，同時(shí)取相應(yīng)癌旁組織作為對照。

1.2 試劑

鼠抗人Ezrin和nm-23單克隆抗體和陽性對照片購自北京中杉生物技術(shù)有限公司，一抗工作濃度1∶200；Envision法檢測試劑盒購自基因生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

采用Envision法，切片脫蠟至水，置入0.01/枸椽酸原修復(fù)液中，微波高溫修復(fù)10 min，然后按照公司提供的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行操作，進(jìn)行顯色，常規(guī)脫水，透明，封片，用公司提供的陽性對照片為對照，用PBS替代一抗為陰性對照。

1.4 免疫組化檢測結(jié)果評定標(biāo)準(zhǔn)

光學(xué)顯微鏡下對染色情況進(jìn)行評估，取5個(gè)高倍視野各計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，Ezrin的評定標(biāo)準(zhǔn)按照Yu等[4]的分級標(biāo)準(zhǔn)分為陰性(無表達(dá))；陽性(<50%細(xì)胞陽性表達(dá)或染色較淺)；強(qiáng)陽性(>50%細(xì)胞陽性表達(dá)且深染)。nm-23陽性標(biāo)準(zhǔn)參照Terada 等[7]的分級標(biāo)準(zhǔn)：以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)均勻棕黃色顆粒為陽性染色細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)<20%為陰性表達(dá)，20%～30%為陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞數(shù)>30%為強(qiáng)陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分別對各指標(biāo)結(jié)果進(jìn)行Wilcoxon秩和檢；采用Spearman秩相關(guān)分析對Ezrin和nm-23的相關(guān)性進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Ezrin及 nm-23在胃組織中的表達(dá)

在胃癌癌旁組織中兩者均有表達(dá)，陽性信號分布于癌細(xì)胞胞膜。Ezrin和 nm-23在胃癌癌旁組織中的表達(dá)分別為21.3%(35/164)，86.6%(142/164)；在癌組織中的表達(dá)分別為48.2%(79/164)，35.4%(58/164)。癌組織中Ezrin及 nm-23的表達(dá)與癌旁組織比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 Ezrin和nm-23在胃癌中的表達(dá)

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組之間、臨床分期Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期之間以及DFS<5年與>5年組之間比較，Ezrin和nm-23表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。Ezrin和nm-23表達(dá)和患者年齡、性別以及腫塊大小無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

表1 Ezrin和nm-23在胃癌中表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

2.3 Ezrin和nm-23在胃癌組織中表達(dá)的關(guān)系

分析發(fā)現(xiàn)，Ezrin表達(dá)高的病例，其nm-23陽性率低，而Ezrin表達(dá)低的病例，其nm-23表達(dá)率偏高，經(jīng)Spearman等級相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，它們之間呈負(fù)相關(guān)性(γ=-0.359，P<0.001)，見表2。

表2 胃癌組織中 Ezrin和nm-23表達(dá)間的關(guān)系(例)

3 討論

大量臨床實(shí)踐表明，腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡的最重要的原因。作為最常見的腫瘤之一，胃癌的5年生存率一直較低，這與胃癌的發(fā)生比較隱匿，出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)已經(jīng)到了中晚期有較大關(guān)系。另外，胃癌轉(zhuǎn)移的早晚存在較大個(gè)體差異，其中的原因比較復(fù)雜，諸多環(huán)節(jié)尚不清楚，但是研究人員通過大量的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Ezrin蛋白與腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移直接相關(guān)[2,3]。Ezrin是ERM(ezrin-radixin-moesin)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白家族成員之一，參與細(xì)胞骨架組建，并通過MEK/ERK信號傳導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)瘤細(xì)胞侵襲表型發(fā)生，參與細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號傳導(dǎo)。通過對骨肉瘤、黑色素瘤以及卵巢癌的研究發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中Ezrin異常高表達(dá)，沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織Ezrin表達(dá)較低，而且Ezrin的表達(dá)與患者的預(yù)后明顯相關(guān)[4～6]。研究發(fā)現(xiàn)，用RNAi 技術(shù)抑制Ezrin高表達(dá)的細(xì)胞株使Ezrin 表達(dá)下調(diào)后，腫瘤轉(zhuǎn)移能力明顯下降[4]。

本研究通過對2004年3月～2006年6月在我院手術(shù)的胃癌患者的資料的回顧和總結(jié)，并應(yīng)用免疫組化的方法檢測胃癌組織中Ezrin的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為4枚或多于4枚的患者和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移少于4枚的患者相比，Ezrin表達(dá)率明顯偏高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Ezrin可能在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中擔(dān)任重要的角色，Ezrin過度表達(dá)或過度活化可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中還可以觀察到，隨著臨床分期的不斷升高(Ⅲ～Ⅳ期)，Ezrin表達(dá)率有顯著性上升，提示Ezrin過度表達(dá)的患者預(yù)后不良。另外，從數(shù)據(jù)中還可以發(fā)現(xiàn)，對于那些無病生存時(shí)間為5年以上的患者，Ezrin表達(dá)明顯低于那些無病生存時(shí)間小于5年的患者，這說明Ezrin對于判斷胃癌預(yù)后具有一定意義。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)在胃癌癌旁組織以及胃良性腫瘤中均有表達(dá)，但它們的表達(dá)分布很規(guī)則，主要分布在腺上皮細(xì)胞胞膜，是1種生理性表達(dá)，與在胃癌中的表達(dá)相比有明顯的不同。

nm-23 基因表達(dá)于正常細(xì)胞,位于人類染色體17q22,包括nm-23H1 及nm-23H2 2個(gè)亞型,兩者有88% 的同源性。其突變見于多種人類腫瘤[7～10]，突變方式最常見的nm-23H1 等位基因丟失。乳腺癌和大腸癌的突變率分別為64% 和52.14%[8]，而卵巢癌的突變率更高，達(dá)76%[9]。目前大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道肯定nm-23H1 基因突變與腫瘤轉(zhuǎn)移存在相關(guān)關(guān)系。nm23抑制轉(zhuǎn)移比較有力的證據(jù)是在乳腺癌中得到證實(shí)[8]，研究表明，nm-23蛋白與包括胃癌在內(nèi)的人類多種腫瘤浸潤有關(guān)。但近年來有研究顯示，nm-23基因并不象抑癌基因p53那樣穩(wěn)定，它在某些癌癥中表現(xiàn)比較混亂，原因是多方面的，推測改變nm-23H1的調(diào)節(jié)可能是轉(zhuǎn)移的起點(diǎn)，而nm-23H1位點(diǎn)喪失在不同腫瘤中的發(fā)生率各不相同，因而會出現(xiàn)不同的研究結(jié)果。但在本研究過程中，我們發(fā)現(xiàn)nm-23蛋白在癌旁組織中顯示高表達(dá)，在癌旁組織中，nm-23的表達(dá)率明顯高于癌組織，并有顯著性差異。在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中，nm-23的表達(dá)率很低，另外，臨床分期早的胃癌患者，nm-23表達(dá)明顯高于分期晚的患者；而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移少于4枚的患者，nm-23的表達(dá)也顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移大于4枚的患者。從其5年無病生存率和nm-23表達(dá)相關(guān)性分析，預(yù)后佳的患者的nm-23表達(dá)陽性率比預(yù)后差的高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明nm-23表達(dá)水平與胃癌預(yù)后呈正相關(guān)，提示nm-23可以抑制胃癌的轉(zhuǎn)移，與其他作者的報(bào)道一致[7],提示nm-23可作為判斷胃癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的參考指標(biāo)。同時(shí)，檢測nm-23在癌組織中的表達(dá)可能還有助于從胃癌患者中篩選出轉(zhuǎn)移高危險(xiǎn)者進(jìn)行治療。

本研究還對Ezrin和nm-23在胃癌組織中表達(dá)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)Ezrin表達(dá)高的患者，nm-23表達(dá)低，預(yù)后差；Ezrin而表達(dá)低的患者，nm-23表達(dá)高，患者的預(yù)后相對較好，兩者之間具有負(fù)相關(guān)性(P<0.01)，提示兩者可能通過多種信號通路共同參與了胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移，參與其中的有多種因素，有學(xué)者認(rèn)為[4]Ezrin過度表達(dá)或過度活化可以使細(xì)胞之間連接松散，細(xì)胞之間的信號傳遞異常，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。我們推測由于Ezrin是細(xì)胞骨架連接蛋白，Ezrin的過表達(dá)干擾了其它相關(guān)基因的功能，有可能影響到nm-23的表達(dá)。異常表達(dá)的nm-23基因可以編碼1種類似二磷酸核苷激酶(NDPK)的蛋白，參與微管的集合和分解，影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞之間的相互關(guān)系，從而也影響了細(xì)胞的正常的生理活動，促進(jìn)了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，同時(shí)也說明，nm-23的異常表達(dá)有助于新生瘤細(xì)胞的擴(kuò)散。Ezrin 和nm-23兩者間相互作用的機(jī)制需要進(jìn)一步的研究加以證實(shí)。

總之，我們發(fā)現(xiàn)Ezrin和nm-23在胃癌組織中表達(dá)高、低與胃癌的分期、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有相關(guān)性，可作為判斷預(yù)后并用于治療的有用的參考指標(biāo)。我們的研究表明，檢測Ezrin及nm-23在胃癌中的表達(dá)并綜合分析，有助于對患者預(yù)后的判斷，對指導(dǎo)臨床治療具有一定參考價(jià)值。

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