結(jié)直腸鋸齒狀通路中DNA甲基化的改變

張玉萍綜述 王魯平審校

在世界范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)的發(fā)病率居惡性腫瘤的第3位，在我國(guó)CRC發(fā)病率逐年上升，已躍居常見惡性腫瘤的前5位，廣東地區(qū)和香港地區(qū)數(shù)字已接近西方國(guó)家[1]。據(jù)報(bào)道2007年10%～15%CRC來(lái)自鋸齒狀病變[2]，而到2011年鋸齒狀病變的發(fā)現(xiàn)率明顯提高。美國(guó)Minnesota大學(xué)Snover教授明確提出35%CRC來(lái)自鋸齒狀病變通路，尤其是來(lái)自CpG島甲基化表型(CIMP)的鋸齒狀病變，與DNA甲基化密切相關(guān)。通過(guò)復(fù)習(xí)文獻(xiàn)對(duì)鋸齒狀通路中DNA甲基化的改變做一綜述，旨在深刻認(rèn)識(shí)鋸齒狀通路中的分子機(jī)制，為臨床提供更準(zhǔn)確的診斷及鑒別診斷方法，以達(dá)到預(yù)防和減少CRC發(fā)病率的目的。

1 鋸齒狀病變

WHO(2010)消化系統(tǒng)腫瘤新分類中把鋸齒狀病變定義為：一組以上皮鋸齒狀結(jié)構(gòu)為特征的病變，包括：①增生性息肉(hyperplastic polyp ,HP)，根據(jù)黏液類型又分為微小泡型(microvesicula HP,MVHP)、杯狀細(xì)胞型(goblet cell rich HP,GCHP)和黏液缺乏型(mucin poor HP,MPHP)；②廣基鋸齒狀息肉/腺瘤(sessile serrated adenoma/polyp,SSA/P)，根據(jù)細(xì)胞異型性分為不伴和伴有細(xì)胞異型增生型；③傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤(traditional serrated adenoma,TSA)；④鋸齒狀腺癌(serrated adenocarcinoma,SAC)。這些病變是1個(gè)連續(xù)的譜系，有明顯的異質(zhì)性，具有特殊的分子改變，呈現(xiàn)1條與經(jīng)典“腺瘤-癌”并存的新的致癌途徑，即所謂的鋸齒狀通路(serrated neoplasia pathway)[2]。更有學(xué)者認(rèn)為可能存在2條平行的、幾乎很少交叉的鋸齒狀通路,即:傳統(tǒng)鋸齒狀通路和廣基鋸齒狀通路。

2 DNA甲基化

DNA甲基化是1種表觀遺傳學(xué)修飾，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT) 的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM) 為甲基供體,將甲基轉(zhuǎn)移到特定的堿基上的過(guò)程。DNA甲基化可以發(fā)生在腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鳥嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位等。但在哺乳動(dòng)物,DNA甲基化主要發(fā)生在5’-CpG-3’的C上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC) 。DNA甲基化修飾異常與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，其中包括基因組去甲基化及部分區(qū)域高度甲基化2種形式。DNA甲基化可導(dǎo)致抑癌相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄沉默，導(dǎo)致異常基因的積累，使病變迅速進(jìn)展為癌。有關(guān)研究表明DNA甲基化是“鋸齒狀通路”中關(guān)鍵的啟動(dòng)因素[3]。

2.1 CpG島甲基化表型(CIMP)

CpG島是指CpG二核苷酸聚集區(qū)域，呈不連續(xù)分布，長(zhǎng)度>200 kb。在整個(gè)基因組中，CpG島通常位于基因的啟動(dòng)區(qū)域，故又稱5’-CpG島。CpG島甲基化在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色?；騿?dòng)子區(qū)CpG島甲基化常阻止基因的表達(dá)，表現(xiàn)這些基因甲基化的癌稱為CpG島甲基化表型陽(yáng)性(CpG island methlylator phenohype ,CIMP)[4]。

一些學(xué)者認(rèn)為CIMP是鋸齒狀通路中的特征性改變[5～7]。Park等[7]對(duì)22例鋸齒狀腺瘤(serrated adenoma，SA)和34例管狀腺瘤患者的CIMP情況進(jìn)行研究，結(jié)果顯示SA中的甲基化位點(diǎn)明顯多于管狀腺瘤(P=0.00001)；此外，CIMP-H(≥2個(gè)甲基化位點(diǎn))在SA中的發(fā)生頻率為68%(15/22)，而在管狀腺瘤中僅為18%(6/34)。同時(shí)大量研究表明CIMP在“鋸齒狀通路”中期“HPs-SAs”的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Yang等[8]采用甲基化特異性PCR(methylation specific PCR,MS-PCR)檢測(cè)79例散發(fā)性HP患者和25例SA患者病理組織中的CIMP-H，結(jié)果顯示CIMP-H在SA中出現(xiàn)的頻率(80%)比在HP中高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017)；且在異常增生型鋸齒狀息肉(serrated polyps with abnormal proliferations，SPAPs)、微小囊泡型鋸齒狀息肉(microvesicular serrated polyps,MVSPs )和杯細(xì)胞型鋸齒狀息肉(goblet cell serrated polyps,GCSPs)中，CIMP-H出現(xiàn)的頻率分別為75%、47.4%、15.4%。且在另一文獻(xiàn)中，CIMP-H在SPAPs 、MVSPs、GCSPs中的頻率分別為92.3%、68.4%和46.2%[9]。根據(jù)CIMP-H在GCSPs、MVSPs、SPAPs和SA中(即從低級(jí)病變到高級(jí)病變)由低到高的頻率分布，可以推測(cè)其在推動(dòng)HP向SA進(jìn)展的過(guò)程中以及在鋸齒狀通路中都起著非常重要的作用，是鋸齒狀通路的特征性改變。

2.2 CpG島甲基化在鋸齒狀病變中的改變

2.2.1 增生性息肉(hyperplastic polyp,HP) HP約占鋸齒狀病變的75%，一般認(rèn)為HP不會(huì)發(fā)生惡變，但新近有足夠的證據(jù)表明HP具有惡變潛能[10]。Kyoung-Mee 等[11]運(yùn)用MS-PCR檢測(cè)45例HPs(包括30例MVHP,11例GCHP和4例MDHP)中MGMT、hMLH1、APC、p16、MINT1、MINT2和MINT31基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的情況，表達(dá)率分別為42.2%、64.4%、37.8%、60%、68.9%、51.1%和60%，其中p16、 MINT2和MINT31在MVHP中的表達(dá)率比在HPs的其他類型中更高(P<0.05)，尤其是在右側(cè)MVHP中。同時(shí)檢測(cè)出CIMP-H在MVHP、GCHP和MDHP中的表達(dá)率分別為73.3%、18.2%、75%，尤其是右側(cè)MVHP中CIMP-H表達(dá)更顯著。此外Kyoung-Mee等[11]還對(duì)30例MVHP和56例SSA/P的病變位置、組織學(xué)形態(tài)、分子學(xué)改變進(jìn)行了大量的對(duì)比研究，得出的結(jié)論是位于右側(cè)結(jié)腸的MVHP可能是SSA/P的1種前驅(qū)病變，比其他類型的HP具有相對(duì)高的惡變潛能。有研究表明CIMP是推動(dòng)MVHP向SSA/P發(fā)展及向后來(lái)的鋸齒狀腺瘤伴異型增生和癌進(jìn)展的分子學(xué)動(dòng)力[12]。因此得出結(jié)論：相關(guān)基因甲基化導(dǎo)致HP的惡變，尤其是右側(cè)MVHP。

2.2.2 廣基鋸齒狀息肉或腺瘤(sessile serrated adenoma/polyp,SSA/P) SSA/P占鋸齒狀病變的15%～20%，目前被認(rèn)為是伴有微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)特征的散發(fā)性CRC的癌前病變[10]。一些重要調(diào)控分子(如DNA錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH1)的啟動(dòng)子甲基化在伴/不伴細(xì)胞異型增生的SSA/P中均有發(fā)生，當(dāng)出現(xiàn)hMLH1啟動(dòng)子甲基化時(shí)，病變具有了MSI特征，從而導(dǎo)致了細(xì)胞學(xué)異型性，使SSA/P具有了進(jìn)展為癌的特性。因此DNA甲基化是SSA/P惡變過(guò)程中的重要事件，且SSA/P不論是否伴有細(xì)胞異型增生，均應(yīng)視為癌前病變[13]。Kyoung-Mee 等[11]運(yùn)用MS-PCR檢測(cè)的56例SSA/P(包括20例不伴異型增生和36例伴異型增生)中MGMT、hMLH1、APC、p16、MINT1、MINT2和MINT31基因啟動(dòng)子區(qū)超甲基化的表達(dá)率分別為69.9%、73.2%、37.5%、76.8%、71.4%、58.9 %和71.4%。在這些腫瘤相關(guān)基因甲基化的表達(dá)率中，除了APC為37.5%，其他的均>50%。同時(shí)檢測(cè)出CIMP-H在不伴和伴有異型增生中的表達(dá)率分別為75.0%和77.8%。以上結(jié)果表明在SSA/P中表現(xiàn)為廣泛的DNA甲基化，DNA甲基化在SSA/P惡變過(guò)程中起關(guān)鍵作用。

2.2.3 傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤(traditional serrated adenoma,TSA) TSA占鋸齒狀病變的1%左右，它在鋸齒狀通路中的作用存在爭(zhēng)議，但研究表明TSA具有惡變?yōu)镃RC的潛能[14]。TSA常與MSI-L特征(如MGMT啟動(dòng)子甲基化)的癌有關(guān),MGMT基因甲基化后，引起一些基因沉默，發(fā)展為MSI-L癌。在表觀遺傳學(xué)方面，主要表現(xiàn)為低水平DNA甲基化[15]。Kyoung-Mee 等[16]收集了112例TSAs，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)MGMT和hMLH1甲基化在TSAs中的表達(dá)率為63%和56%。而且發(fā)現(xiàn)在鋸齒狀通路中，TSA進(jìn)展主要伴隨著hMLH1甲基化和BRAF基因突變，而MGMT甲基化和KRAS基因突變是此通路中的1個(gè)晚期事件，這些腫瘤相關(guān)基因異常甲基化和突變證明TSA具有一定的惡變潛能。但是DNA甲基化在TSA惡變中的作用尚不十分明確，仍需更深入的研究。

2.2.4 鋸齒狀腺癌(serrated adenocarcinoma， SAC) SAC是由具有惡變潛能的TSA、SSA等鋸齒狀病變沿鋸齒狀通路發(fā)展而來(lái)的，是鋸齒狀通路的終點(diǎn)。SAC的發(fā)生與CpG島甲基化密切相關(guān)：①傳統(tǒng)鋸齒狀通路所引起的SAC，大多由KRAS突變引發(fā)。KRAS突變導(dǎo)致早期的鋸齒狀損害TSA和GCHP[17]，而且會(huì)引起低水平CpG島甲基化現(xiàn)象(CIMP-L)。CIMP使MGMT基因啟動(dòng)子出現(xiàn)甲基化而失活，導(dǎo)致TSA病變的異型性程度進(jìn)一步增加，最終發(fā)展成為SAC。②廣基鋸齒狀通路所引起的SAC，主要是由BRAF突變所引起的。BRAF突變導(dǎo)致了早期鋸齒狀損害MVHP和SSA，也促進(jìn)了基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化[17]。據(jù)研究MVHP和SSA均表達(dá)較高的CIMP-H[11]，而CIMP-H會(huì)導(dǎo)致相關(guān)病理性的基因沉默，如hMLH1。在廣基鋸齒狀通路中，hMLH1甲基化是1個(gè)晚期事件，導(dǎo)致SSA異型程度進(jìn)一步增加，最終發(fā)展成為SAC[17]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)hMLH1甲基化只出現(xiàn)在廣基鋸齒狀通路中而不出現(xiàn)在傳統(tǒng)鋸齒狀通路中， 而MGMT甲基化在2條通路中均可見[18]。CIMP-H是廣基鋸齒狀通路的重要特征，而CIMP-L則常出現(xiàn)在傳統(tǒng)鋸齒狀通路中[19]，由此可見CIMP是TSA、SSA發(fā)展成SAC的關(guān)鍵，鋸齒狀通路中起了重要的作用。

3 鋸齒狀病變分子遺傳學(xué)與DNA甲基化的關(guān)系

3.1 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與DNA甲基化

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI)是復(fù)制錯(cuò)誤(replication error,RER)引起的微衛(wèi)星DNA序列改變，使基因失去正常生理調(diào)控功能，引起細(xì)胞增生及分化異常，參與腫瘤發(fā)生。目前研究表明，與傳統(tǒng)腺瘤-癌途徑相比，MSI常出現(xiàn)在鋸齒狀通路中，MSI的發(fā)生主要與hMLH1和MGMT啟動(dòng)子區(qū)甲基化有關(guān)。Hawkins等[20]選取了29例MSI結(jié)直腸癌和29例微衛(wèi)星穩(wěn)定((microsatellite stability ,MSS)結(jié)直腸癌患者進(jìn)行對(duì)比研究，結(jié)果顯示MSI結(jié)直腸癌含較多的鋸齒狀息肉，而且hMLH1基因的甲基化失活在MSI和MSS結(jié)直腸癌中的比率分別為76.9%(10/13)和0，因此可推測(cè)hMLH1基因啟動(dòng)子甲基化失活可能是鋸齒狀息肉發(fā)展為MSI結(jié)直腸癌的危險(xiǎn)因素。Jass等[21]通過(guò)研究11例結(jié)直腸癌和13例不典型增生樣病變發(fā)現(xiàn)，在13例不典型增生樣病變中有7例呈現(xiàn)MSI，其中4例是MSI-H，hMLH1都沒有表達(dá)，3例是MSH-L，hMLH1都有表達(dá)；11例結(jié)直腸癌中8例呈現(xiàn)MSI，其中6例是MSI-H，hMLH1都沒有表達(dá)，2例MSH-L，hMLH1都有表達(dá)。hMLH1的表達(dá)缺失和hMLH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化有關(guān)，因此上述結(jié)果表明hMLH1甲基化和MSI-H密切相關(guān)。同時(shí)Whitehall等[22]選取31例鋸齒狀息肉(包括增生性息肉、HP/AD和鋸齒狀腺瘤)，其中29%(9/31)出現(xiàn)MGMT的表達(dá)缺失，這些表達(dá)缺失由MGMT的啟動(dòng)子甲基化引起。MGMT表達(dá)缺失的9例中，7例呈現(xiàn)MSI，其中5例呈現(xiàn)MSI-L，2例呈現(xiàn)MSI-H，因此可推斷MGMT甲基化與MSI-L相關(guān)。以上研究表明在鋸齒狀通路中MSI的發(fā)生與DNA甲基化有關(guān)，尤其是hMLH1和MGMT啟動(dòng)子區(qū)甲基化。

3.2 BRAF基因突變與DNA甲基化的關(guān)系

BRAF錯(cuò)義突變發(fā)生于近8%人類腫瘤中，約15%結(jié)直腸癌患者有BRAF基因突變[23]。研究表明BRAF突變是鋸齒狀通路中1個(gè)特殊的分子標(biāo)志，起源于鋸齒狀異常隱窩灶或MVHP中，隨著CIMP-H的出現(xiàn)，形態(tài)學(xué)逐漸表現(xiàn)異型增生，最終進(jìn)展為癌。一些學(xué)者對(duì)“鋸齒狀通路”中的增生性息肉、鋸齒狀腺瘤等進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)在BRAF突變的組織中幾乎都存在CIMP陽(yáng)性表達(dá)[24]。還有研究發(fā)現(xiàn)CIMP-H是伴BRAF突變的鋸齒狀病變的重要特征[19]。Kambara等[3]通過(guò)對(duì)57例鋸齒狀息肉和145例CRC的研究發(fā)現(xiàn)BRAF基因突變與DNA甲基化存在著一定的關(guān)系，根據(jù)甲基化位點(diǎn)的多少，將CpG島甲基化表型分為 CIMP-H、CIMP-L和非CIMP 3組，在鋸齒狀息肉中BRAF基因在這3組的突變率分別為72%、30%、13%(P=0.002)，CRC在3組的突變率分別為77%、18%、0(P<0.0001)。因此在鋸齒狀通路中BRAF基因突變與CIMP密切相關(guān)，尤其是CIMP-H。

3.3 KRAS基因與DNA甲基化的關(guān)系

KRAS是與BRAF在同一信號(hào)途徑中相繼發(fā)揮作用的另一個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，兩者相互獨(dú)立,研究表明KRAS發(fā)生在GCHP和TAS中。GCHP通常較小，缺乏可確認(rèn)的后續(xù)病變，表明GCHP不大可能是鋸齒狀通路的前驅(qū)病變[25]。但是有研究表明在GCHP中KRAS突變率可達(dá)50%[26]，且在傳統(tǒng)鋸齒狀通路中GCHP可能是TAS的前驅(qū)病變。同時(shí)Kyoung-Mee等[11]發(fā)現(xiàn)CIMP在GCHP中表達(dá)水平可達(dá)18.2%[11]，所以可推測(cè)由于KRAS突變和CIMP的發(fā)生，GCHP具有一定的惡變潛能。TSA中KRAS突變率報(bào)道不一，可達(dá)36%[27]。KRAS突變的TSA可進(jìn)展為混合性管狀絨毛狀腺瘤表型，后期可獲得高度異型增生并進(jìn)展為癌,該過(guò)程的主要分子學(xué)基礎(chǔ)是CIMP-L，而有關(guān)研究也表明KRAS基因突變常常伴有CIMP-L[28]。在鋸齒狀癌變途徑中關(guān)于KRAS基因突變與DNA甲基化的關(guān)系尚不十分明確，有待于進(jìn)一步的研究。

3.4 RUNX3基因與DNA甲基化

RUNX3[29]是1個(gè)新的抑癌基因，是TGF-β轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)起調(diào)控作用的1個(gè)重要環(huán)節(jié)。Ku等[30]采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析和甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)了32種結(jié)直腸癌細(xì)胞系和87例癌組織中RUNX3基因的突變雜合性缺失和啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)有16種癌細(xì)胞系存在RUNX3基因表達(dá)缺失或下調(diào)，其中75%(12/16)存在啟動(dòng)子的高甲基化。在87例癌組織中有16例(18.4%)檢測(cè)到RUNX3基因的甲基化，而在相應(yīng)的正常組織中均未發(fā)現(xiàn)RUNX3基因的甲基化。Subramaniam等[31]通過(guò)免疫組化方法比較發(fā)現(xiàn)HP和TSA中RUNX3的陽(yáng)性表達(dá)率較正常結(jié)腸黏膜組織和管狀腺瘤(Tubular adenoma,TA)中有所下降；并應(yīng)用甲基化特異性PCR來(lái)檢測(cè)RUNX3啟動(dòng)子的高度甲基化，以12例正常腸組織黏膜作對(duì)照，結(jié)果顯示：SA包括HP和TSA，較TA中RUNX3的甲基化表達(dá)率明顯增高。由此我們得出結(jié)論，鋸齒狀病變中RUNX3基因的失活與甲基化密切相關(guān)，而且可推測(cè)由RUNX3的失活引起的啟動(dòng)子甲基化是SA惡變過(guò)程中的1個(gè)早期事件。

總之，越來(lái)越多的研究證明鋸齒狀病變的惡變潛能高于傳統(tǒng)的息肉/腺瘤[32]，主要的惡變途徑是鋸齒狀通路，但是目前對(duì)該通路的研究尚不完善，尤其是在表觀遺傳學(xué)方面。正確的認(rèn)識(shí)鋸齒狀通路中DNA甲基化的改變，將為鋸齒狀病變提供可靠的鑒別診斷方法，對(duì)于早期診斷鋸齒狀癌前期病變和理解癌變機(jī)制也具有重要的科學(xué)意義，而且可以獲得CRC早期預(yù)防、診斷及高發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)記物。雖然研究已表明CRC有若干高度甲基化的基因，而且不同類型鋸齒狀病變也伴有不同基因的異常甲基化，但是它們之間關(guān)系尚不十分清楚，因此鋸齒狀通路中DNA甲基化的改變有待于進(jìn)一步研究。

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