FOXC1與基底樣乳腺癌的研究進(jìn)展

付 晶 盧康平綜述 張清媛審校

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。近年來，以基因表達(dá)譜為基礎(chǔ)的乳腺癌基因分型將乳腺癌分為4個亞型[1]，其中基底樣乳腺癌因表型獨特，侵襲性強，預(yù)后差等特點引起廣泛關(guān)注。基底樣乳腺癌(basal-like breast cancer,BLBC)是以表達(dá)基底細(xì)胞或肌上皮細(xì)胞相關(guān)蛋白為特點的乳腺癌，其雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)及人表皮生長因子受體 2 (human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)常表達(dá)為陰性。BLBC好發(fā)于絕經(jīng)前的非洲裔美國女性，占乳腺癌總發(fā)病率的15%，占三陰性乳腺癌發(fā)病率的60%～90%[2]，平均發(fā)病年齡為47～55歲，組織學(xué)類型以浸潤性導(dǎo)管癌和髓樣癌為主[3]，組織學(xué)分級高，易出現(xiàn)腦、肺轉(zhuǎn)移，且對內(nèi)分泌治療及靶向治療不敏感。在BLBC所表達(dá)的標(biāo)志物中，CK5/6是目前被認(rèn)為診斷BLBC的指標(biāo)，被廣泛應(yīng)用[4]，但其表達(dá)不具特異性。因BLBC沒用統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，不同研究者定義BLBC標(biāo)準(zhǔn)不同，研究結(jié)果也不盡相同。所以BLBC的特異性分子標(biāo)志物的界定成為急需解決的關(guān)鍵問題。在尋找特異性分子標(biāo)志物的過程中，轉(zhuǎn)錄因子FOXC1(Forkhead box C1)因在BLBC中高表達(dá)[2]而成為研究BLBC的熱點。我們就FOXC1在乳腺癌中的表達(dá)、促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展機制及其與預(yù)后的關(guān)系作一綜述。

1 FOXC1的分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特點

FOX(Forkhead box)家族是1個龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛存在于從酵母到人類的不同種屬，其成員分屬19個亞家族，即FOXA-FOXS。FOX家族成員具有高度保守的DNA結(jié)合區(qū)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，主要通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)節(jié)組織特異性基因表達(dá)、胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移和凋亡等多個生物學(xué)過程。轉(zhuǎn)錄因子FOXC1是FOX家族的一員，位于人染色體6p25基因編碼區(qū)，分子量為56789 Da，全長3.5 kb，含有1個長度為1.6 kb的外顯子，編碼的蛋白質(zhì)大小為553個氨基酸。FOXC1因含有3個a-螺旋，3個β折疊和2個特征性翼狀的大環(huán)結(jié)構(gòu)而呈螺旋翼狀結(jié)構(gòu)。FOXC1蛋白從N端到C端的結(jié)構(gòu)依次為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(AD1)，DNA結(jié)合叉頭區(qū)(FHD)，抑制區(qū)/磷酸化區(qū)和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(AD2)。叉頭區(qū)的兩端均有1個核定位信號(NLS)，位于C端的NLS為經(jīng)典基序。FOXC1的功能研究主要集中在胚胎、器官發(fā)育及組織特異性基因表達(dá)方面。在FOXC1基因敲除的動物模型中觀察到，心臟、腎臟、腦膜、骨骼、體節(jié)及眼部視前段的發(fā)育均出現(xiàn)嚴(yán)重缺陷[5]。同時，F(xiàn)OXC1也是眼睛發(fā)育過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子，其基因突變可導(dǎo)致多種青光眼表型和人類阿克森費爾德·里格爾綜合征(ARS)。近期研究表明，F(xiàn)OXC1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。對婦科腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌的組織分化程度越低，侵襲性越強，F(xiàn)OXC1 蛋白表達(dá)越低，表明FOXC1蛋白的表達(dá)與宮頸癌惡性程度呈負(fù)相關(guān)[6]。

2 FOXC1與乳腺癌

2.1 FOXC1在乳腺癌分子分型中的表達(dá)

Nielsen 等提出的用免疫組化代替基因圖譜診斷BLBC的標(biāo)準(zhǔn)為ER、HER2表達(dá)陰性，基底細(xì)胞角蛋白(CK5/6，CK14，CK17)、EGFR或者 c-kit表達(dá)陽性的乳腺癌[7]。Ray等[2]在以基因圖譜分類的4種乳腺癌分子分型中分別檢測FOXC1、CK5、CK14、EGFR、c-kit及P-cadherin的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC1在基底樣乳腺癌中表達(dá)明顯高于其他各組亞型。同樣地，在已知ER、PR和HER2表達(dá)狀態(tài)下檢測FOXC1在乳腺癌組織標(biāo)本中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三陰性乳腺癌組FOXC1 表達(dá)顯著高于其他亞組。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC1僅在表達(dá)基底細(xì)胞角蛋白的三陰性乳腺癌細(xì)胞中細(xì)胞核呈強染色。統(tǒng)計表明，F(xiàn)OXC1陽性表達(dá)伴隨基底細(xì)胞角蛋白表達(dá)，其敏感性0.81，特異性0.8。綜上所述，F(xiàn)OXC1是BLBC的特異性標(biāo)志物，可以成為診斷BLBC的潛在分子標(biāo)志物。

2.2 FOXC1在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制

2.2.1 促進(jìn)細(xì)胞增殖的機制 FOXC1可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。研究[2]發(fā)現(xiàn)，將表達(dá)FOXC1的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人MDA-MB-231細(xì)胞株后，腫瘤細(xì)胞增殖能力明顯增強。應(yīng)用MCF-7乳腺癌細(xì)胞株也得到同樣結(jié)果。有趣的是，研究中發(fā)現(xiàn)FOXC1高表達(dá)的MCF-7細(xì)胞在瓊脂中可以呈現(xiàn)不依賴支持物的生長。相反地，將基因敲除的FOXC1 shRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)到高表達(dá)內(nèi)源性FOXC1的Ⅳ期人乳腺癌鼠模型[8]中，該模型成瘤能力明顯減弱。通過對BT549人乳腺癌細(xì)胞株的研究也得到同樣的結(jié)果。此外，研究[2]還發(fā)現(xiàn)FOXC1可促進(jìn)cyclin D1表達(dá)增加。在正常乳腺細(xì)胞中，cyclin D1在細(xì)胞周期G1/S期發(fā)揮限速作用。而在乳腺癌細(xì)胞中，原本在S期降解的cyclinD1被激活并高表達(dá)，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞的G1期縮短，提前進(jìn)入S期，進(jìn)而細(xì)胞增殖失控，腫瘤形成。因此，F(xiàn)OXC1可能通過調(diào)節(jié)cyclin D1的表達(dá)參與細(xì)胞增殖的調(diào)控。

2.2.2 促進(jìn)細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移的機制 研究發(fā)現(xiàn)FOXC1可促進(jìn)MMP2和MMP9表達(dá)增加[2]。MMP2和MMP9是金屬蛋白酶家族成員中已知與乳腺癌關(guān)系最密切的2個因子，可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)癌細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移。MMP2和MMP9可能作為FOXC1的下游靶點，參與FOXC1對細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移的調(diào)控。統(tǒng)計資料[2]表明，乳腺癌腦轉(zhuǎn)移患者FOXC1表達(dá)增多，且FOXC1表達(dá)增加與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移患者數(shù)量增多成正相關(guān)。有趣的是，F(xiàn)OXC1雖然在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的患者中高表達(dá)，但FOXC1并非是乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的主控基因,提示 FOXC1可能在此過程中起到協(xié)同作用。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC1可促進(jìn)波形蛋白、纖維連接蛋白和a-平滑肌肌動蛋白等成纖維細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)升高；相反，在FOXC1蛋白缺失的4T1細(xì)胞中可觀察到成纖維樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變成上皮樣細(xì)胞的現(xiàn)象出現(xiàn)。這兩項結(jié)果表明FOXC1可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。上皮細(xì)胞在EMT的過程中因喪失極性，而獲得活動能力，可在細(xì)胞基質(zhì)間游走[9]，形成局部擴散，進(jìn)而侵入淋巴管及血管，從而發(fā)生轉(zhuǎn)移[10]。Bloushtain-Qimron等[11]在MCF-12A細(xì)胞株中證實了FOXC1誘導(dǎo)乳腺癌上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的作用。另有研究[12]表明，在緊密連接蛋白claudin呈低表達(dá)的乳腺癌中，F(xiàn)OXC1過表達(dá)不僅能作為EMT的獨立誘導(dǎo)劑，還能上調(diào)其他EMT誘導(dǎo)劑，如Goosedoid、Snail、Twist和TGF-β1等，這些因子協(xié)同參與EMT的發(fā)生。

2.2.3 促進(jìn)血管、淋巴管發(fā)育的機制 在脈管形成過程中，F(xiàn)OXC1參與成血管細(xì)胞動脈分化、動脈標(biāo)志物誘導(dǎo)和淋巴管的出芽生成。Seo[13]和Hayashi等[14]的研究表明， FOXC1通過激活Dll4和Hey2的啟動子誘導(dǎo)動脈標(biāo)志物Notch1和Dll4的過表達(dá)，并在 VEGF-Dll4-Notch-Hey2信號通路作用下共同調(diào)節(jié)動脈基因的表達(dá)。實驗表明FOXC1參與成血管細(xì)胞動脈分化的調(diào)節(jié)。FOXC1和FOXC2復(fù)合突變的鼠胚胎模型表現(xiàn)出在主動脈弓水平，背主動脈和前主靜脈融合，動脈標(biāo)志物的誘導(dǎo)缺陷，而靜脈標(biāo)志物正常表達(dá)，這進(jìn)一步說明突變的上皮細(xì)胞因為動脈分化失敗而導(dǎo)致動靜脈畸形的發(fā)生和血管重塑的缺陷[13]。Hayashi等[15]研究表明FOXC1還通過激活CXCR4啟動子調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移。FOXC1缺失的內(nèi)皮細(xì)胞CXCR4表達(dá)下降，同時CXCL12誘導(dǎo)細(xì)胞遷移能力也隨之下降。已知CXCR4-CXCL12信號通路可啟動腫瘤原有血管生長或來自骨髓募集的表達(dá)CXCR4的內(nèi)皮干細(xì)胞生長來誘導(dǎo)新生血管生成[16,17]。這一結(jié)果提示FOXC1可能通過CXCR4-CXCL12信號通路參與腫瘤血管的生成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。另外，研究[13]還表明FOXC復(fù)合突變(FOXC1+/-;FOXC2-/-)導(dǎo)致淋巴上皮細(xì)胞在淋巴系統(tǒng)形成早期出芽生成障礙。FOXC1在主靜脈周圍的間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，而這一區(qū)域是淋巴內(nèi)皮細(xì)胞分化和淋巴系統(tǒng)出芽生成的場所。在FOXC基因突變的鼠模型中，表達(dá)Prox1(淋巴內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物)的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而且淋巴囊的形成也出現(xiàn)異常。雖然還沒有FOXC1直接參與腫瘤血管及淋巴管生成的研究，但這些實驗結(jié)果提示FOXC1可能在這一過程中起重要作用，但還有待進(jìn)一步的研究證實。

3 FOXC1與基底樣乳腺癌預(yù)后的關(guān)系

FOXC1的表達(dá)與基底樣乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)。Dejeux等[18]的研究指出，F(xiàn)OXC1在BLBC中通常呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)，且FOXC1無甲基化的乳腺癌患者死于乳腺癌的風(fēng)險高于FOXC1甲基化的乳腺癌患者。Ray等[2]根據(jù)乳腺癌患者病灶組織中是否表達(dá)FOXC1，將295例Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌患者分組，再依據(jù) FOXC1mRNA水平將其分成2個亞組，分別統(tǒng)計各組的10年生存率。統(tǒng)計結(jié)果如下：FOXC1表達(dá)組與FOXC1無表達(dá)組10年生存率分別為55%和75%(P=0.0004)；FOXC1mRNA高表達(dá)組與FOXC1mRNA低表達(dá)組分別為55%和75%(P=0.0001)。實驗證明FOXC1表達(dá)水平與三陰性乳腺癌患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。研究者[19]再次根據(jù)BLBC的生物學(xué)分子標(biāo)志物將其分為3種模型，分別為3-分子標(biāo)志物模型(TNP即ER-，PR-，HER2-)、4-分子標(biāo)志物模型(TNP+FOXC1)和5-分子標(biāo)志物模型(TNP+CK5/6+CK14)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與其他兩組比較，4-分子標(biāo)記物模型的BLBC患者5年及10年總生存率最低。4-分子標(biāo)記物模型因生存率最低而對預(yù)后有重要預(yù)測價值。該實驗進(jìn)一步證明了FOXC1可成為BLBC的預(yù)后指標(biāo)，且最有可能真實再現(xiàn)BLBC分子亞型的生物學(xué)特點。

基因表達(dá)譜是檢測BLBC的金標(biāo)準(zhǔn)，但因成本高限制該方法在臨床上的應(yīng)用。免疫組化作為更經(jīng)濟，更便捷的檢測方法被普遍采納。然而目前國際上沒有統(tǒng)一的界定BLBC診斷標(biāo)準(zhǔn)的免疫組化標(biāo)識，建議的診斷性免疫組化標(biāo)志物TNP、CKs、EGFR和c-kit缺乏特異性，不能全面反應(yīng)BLBC的特點。研究表明FOXC1在BLBC中特異性表達(dá)，并在乳腺癌發(fā)生發(fā)展的過程中起著促進(jìn)增殖、轉(zhuǎn)移、浸潤的作用，其作為免疫組化標(biāo)識能更好地體現(xiàn)BLBC的生物學(xué)特性。FOXC1蛋白是BLBC的潛在診斷分子標(biāo)志物和特異性預(yù)后生物標(biāo)志物。針對FOXC1在乳腺癌形成過程中的作用，對其行以FOXC1為靶點的治療為個體化治療BLBC指明了方向，而FOXC1蛋白能否對BLBC有治療意義還有待進(jìn)一步的研究證實。

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