VEGF-C，VEGF-D在乳腺癌中的表達及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系

趙迎春 李 勇 朱永云 羅傳瑜

近年來我國乳腺癌的發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢、死亡率占女性惡性腫瘤死亡率的第2位[1]，嚴重威脅女性健康。乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是其最主要的轉(zhuǎn)移形式，也是臨床評估乳腺癌患者病情及預(yù)后的重要指標(biāo)，但乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機制目前尚不十分明確。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族的血管內(nèi)皮生長因子-C(VEGF-C)和VEGF-D 以及位于淋巴管內(nèi)皮上的血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR-3)是目前公認的調(diào)控淋巴管生成最為重要的信號傳導(dǎo)通路的生長因子，能夠誘導(dǎo)淋巴管的生成及腫瘤細胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,但其在乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后中的作用尚不明確。 我們對VEGF-C,VEGF-D在乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用以及對于乳腺癌患者預(yù)后的影響進一步探討，以期為預(yù)測乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后提供依據(jù)，為乳腺癌的綜合治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2005年10月～2006 年10月在蕪湖市第二人民醫(yī)院乳腺外科接受診斷和治療及資料完整、經(jīng)手術(shù)病理確診的78例乳腺癌患者為研究對象。全部患者為女性，平均年齡為50.8歲(29～72歲)；其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者36例，未轉(zhuǎn)移者42例；浸潤性導(dǎo)管癌69例,浸潤性小葉癌9例；腫瘤直徑<2 cm者21例，腫瘤直徑≥2 cm者57例；按國際抗癌聯(lián)盟(UICC)TNM分期Ⅰ期16例，Ⅱ期44例，Ⅲ期18例；患者術(shù)前均未接受過化療、放療等治療。以同期送檢的30例癌旁組織作為研究對照。

1.2 免疫組化染色

78 例乳腺癌及30例乳腺癌癌旁正常組織蠟塊均行4 μm 連續(xù)切片，分別作HE和免疫組織化學(xué)染色。鼠抗人VEGF-D 多克隆抗體、鼠抗人VEGF-C單克隆抗體購自美國R&D公司，采用免疫組化SP(鏈霉素親生物素一過氧化物酶)法,觀察血管內(nèi)皮生長因子C、D在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達。用已知的乳腺癌陽性切片作陽性對照，用PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定

VEGF-C,VEGF-D陽性染色指顯微鏡下觀察細胞胞質(zhì)內(nèi)具有清晰可見的，定位準(zhǔn)確的棕黃色顆粒，而背景清晰。每張切片選擇有代表性的區(qū)域，在100倍視野下觀察5個視野，根據(jù)陽性細胞染色強度及陽性細胞的面積來判斷結(jié)果。陽性細胞的染色強度按照無著色、淡黃、棕黃、棕褐色分別記為0,1,2,3分。陽性細胞的面積分為0%為0分，1%～10%為1分，11%～50%為2分，50%～75%為3分，≥75%為4分。兩項乘積0～3分為低表達，≥4分為高表達。

1.4 隨診

患者治療結(jié)束后，前兩年每3個月回院復(fù)查，以后每6個月復(fù)查，未定期復(fù)查的通過電話方式隨訪。截止至2011年12月，所有病例都完成至少5年的隨訪,78例患者均有完整隨訪資料。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行分析。各相關(guān)因素的差異性比較采用χ2檢驗，生存分析選用Kaplan-meier法，顯著性檢驗采用Log-rank檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行處理。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織、腫瘤旁正常組織中VEGF-C、VEGF-D蛋白的表達情況

乳腺癌組織免疫組化染色結(jié)果顯示VEGF-C、VEGF-D蛋白高表達率分別為47.4%(37/78)、32.1%(25/78)；30例乳腺癌旁正常組織中分別有4例和1例高表達，高表達率分別為13.3%(4/30)、3.3%(1/30)，兩者蛋白表達水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),說明腫瘤組織中VEGF-C及VEGF-D的表達水平明顯高于腫瘤周邊正常組織。進一步分析腫瘤組織中VEGF-C與VEGF-D表達的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，VEGF-C與VEGF-D的表達無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

2.2 乳腺癌中VEGF-C、VEGF-D蛋白表達與臨床病理因素的關(guān)系

78例乳腺癌組織中VEGF-C、VEGF-D蛋白的表達水平與年齡、腫瘤大小、臨床分期及ER,PR,Her-2的表達情況無關(guān)(P>0.05)。但VEGF-C/D的表達水平與腫瘤脈管內(nèi)浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，見表1。

2.3 VEGF-C,VEGF-D的表達水平與乳腺癌患者的總生存期(OS),無病生存期(DFS)的關(guān)系

Kaplan-meier生存曲線顯示乳腺癌患者的OS與VEGF-C,VEGF-D的表達水平呈負相關(guān),VEGF-C，VEGF-D高表達者OS明顯低于VEGF-C,VEGF-D低表達者，Log-rank檢驗P=0.024(VEGF-C)和P=0.035(VEGF-D),見圖1A,B。同時Kaplan-meier生存曲線顯示乳腺癌患者的DFS也與VEGF-C/D的表達呈負相關(guān)，VEGF-C/D高表達者DFS明顯低于VEGF-C/D低表達者，Log-rank檢驗P<0.05,見圖1C,D。

表1 VEGF-C、D的表達與乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系

圖1 VEGF-C/D表達水平與患者OS,DFS關(guān)系的生存曲線

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移被認為是乳腺癌患者最重要的預(yù)后指標(biāo)之一。過去，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移被認為是1個被動過程， 脫落的腫瘤細胞通過原有的局部淋巴管的引流到達淋巴結(jié)。而目前大量研究表明淋巴管生成作為腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機制已被多數(shù)學(xué)者認可，淋巴管生成受淋巴管生成因子及其受體的介導(dǎo)和調(diào)控，VEGF-C和VEGF-D 是最先被確認能在體內(nèi)介導(dǎo)新生淋巴管生長的生長因子。

VEGF-C于1996年從人前列腺癌細胞系PC3中分離純化，是最早被發(fā)現(xiàn)的促淋巴管生成因子，具有調(diào)節(jié)血管生成、淋巴管生成和脈管通透性等作用，參與多種生理和病理過程。但目前的多數(shù)研究證實VEGF-C通過與其受體VEGFR-3特異性結(jié)合后經(jīng)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidy1inositol-3 kinase)途徑調(diào)控淋巴管內(nèi)皮細胞增生，誘導(dǎo)腫瘤淋巴管生成是各類腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要機制[2]。動物實驗及臨床研究均發(fā)現(xiàn)VEGF-C和VEGFR-3表達增高可促進腫瘤淋巴管生成及增加淋巴管密度，從而促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并與諸多瘤體的預(yù)后密切相關(guān)，包括頭頸部鱗癌、甲狀腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、胃癌、結(jié)直腸癌等[3～6]。Hu等[7]用免疫組化法檢測98例乳腺癌發(fā)現(xiàn)VEGF-C表達陽性率為90.8%，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組VEGF-C表達陽性率顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組，表明VEGF-C與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Huang等[8]用免疫組化及原位雜交法檢測89例原發(fā)性乳腺癌發(fā)現(xiàn)VEGF-C 陽性表達率55.06%，VEGF-C表達與淋巴管密度及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)；VEGF-C mRNA表達陽性組淋巴管密度及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率顯著高于VEGF-C mRNA表達陰性組。同時Mohammed等[9]研究認為VEGF-C的表達水平與腫瘤的淋巴管密度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切正相關(guān)，而且VEGF-C表達水平與患者發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移及總生存率密切相關(guān)，VEGF-C表達水平越高患者越可能發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，總生存率顯著降低。Mandriota等[10]和Koptstein等[11]通過對雙重轉(zhuǎn)基因小鼠胰腺β細胞模型的研究，發(fā)現(xiàn)VEGF-C/VEGF-D高表達的轉(zhuǎn)基因小鼠，能特異性地促進胰島周圍的淋巴管生成及遠處轉(zhuǎn)移，提供了VEGF-C/VEGF-D-VEGFR-3信號通路特異性介導(dǎo)新生淋巴管生成、促進腫瘤細胞播散和向區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的直接證據(jù)。本組試驗結(jié)果顯示乳腺癌組織中VEGF-C高表達率為47.4% ，顯著高于乳腺良性疾病(P<0.05)，顯示VEGF-C在乳腺癌中過表達；乳腺癌VEGF-C蛋白的表達與患者年齡、腫瘤大小、臨床分期以及激素受體狀態(tài)等無關(guān)(P>0.05)，但與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及脈管內(nèi)侵犯密切相關(guān)(P<0.05)，腫瘤發(fā)生淋巴管浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，VEGF-C表達水平越高，與近期上述的國內(nèi)外研究報道基本一致。同時本研究同時發(fā)現(xiàn)VEGF-C的表達水平也與患者的總生存率及無病生存率密切相關(guān)，這與Nakamura等[12]的研究報道一致，VEGF-C表達水平越高，患者的總生存率及無病生存率越低。上述的研究結(jié)果提示VEGF-C可能與淋巴管內(nèi)皮細胞上VEGFR-3特異性結(jié)合，刺激淋巴管內(nèi)皮細胞增殖，形成新生淋巴管，導(dǎo)致癌周組織中淋巴管密度的增高，為腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件，而且新生淋巴管管壁較薄，基膜不連續(xù)或缺少基膜，更有利于腫瘤細胞播散、存活及轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致患者更差的生存期。

VEGF-D是Achen等在1998年研究發(fā)現(xiàn)的。但目前對于VEGF-D 在乳腺癌中的表達水平，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系以及其預(yù)后價值，目前仍存在爭議。部分研究結(jié)果認為VEGF-D的高表達與惡性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或不良預(yù)后密切相關(guān)，但也有研究認為兩者間沒有顯著相關(guān)性。Koyama[13]和Hanrahan等[14]研究認為VEGF-D的表達水平在腫瘤中并不明顯升高，而在正常組織中明顯升高，并與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后無明顯相關(guān)性。但大多數(shù)研究者認為VEGF-D是腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測因素或者是獨立的預(yù)后因素。Stacker 等[15]在小鼠腫瘤異種移植模型中證實VEGF-D 能夠誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)淋巴管的形成， 此外腫瘤細胞上表達的VEGF-D能夠促進腫瘤細胞向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。用VEGF-D的特異性抗體VD1可以阻斷VEGF-D介導(dǎo)的淋巴管擴散。同時有研究[16]表明VEGF-D 還是乳腺癌細胞的重要存活因子，表達VEGF-D的乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231能夠抵抗由缺氧、星形孢菌素(STS)和環(huán)己酰亞胺(CHX)誘發(fā)的凋亡， 這可能和Bcl-2表達增加，caspase 活性降低和聚ADP-核糖聚合酶(PARP)剪切受抑制有關(guān)。Nakamura等17]研究也認為VEGF-D在乳腺癌中明顯表達增強，并與患者的淋巴管密度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，VEGF-D的表達水平與患者的預(yù)后呈明顯的負相關(guān)。上述實驗結(jié)果的差異性究其原因可能是由于這種生長因子在不同腫瘤內(nèi)酶解加工的程度不同， 或是同時存在其它淋巴管生長因子的調(diào)控機制。另外，不同研究結(jié)果間的差異也可能與實驗標(biāo)本本身、實驗使用的抗淋巴管標(biāo)記物或檢測方法不同有關(guān)。在本研究中VEGF-D在乳腺癌中的高表達率明顯升高，提示VEGF-D 在乳腺癌中也是過表達的，同樣VEGF-D的表達水平與年齡，腫塊大小，臨床分期等臨床病理因素?zé)o關(guān)，但VEGF-D 的表達水平與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管內(nèi)侵犯密切相關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組及脈管內(nèi)侵犯組中VEGF-D的高表達率明顯高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移及脈管內(nèi)未侵犯的患者。同時本研究也發(fā)現(xiàn)，VEGF-D的表達水平與患者的總生存率(OS)及無病生存率(DFS)密切相關(guān)，這也與Nakamura等[17]的結(jié)果相近。

綜上所述，本項研究表明VEGF-C，VEGF-D的表達水平與乳腺癌脈管內(nèi)侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并且VEGF-C、D的表達水平與患者的總生存期，無病生存期也密切相關(guān)。通過對VEGF-C、D表達水平的檢測或許能夠?qū)σ父C淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險和評價患者預(yù)后提供一定幫助。但對于兩者在乳腺癌中的相互作用以及在乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中所起的作用尚需進一步研究，并希望能夠?qū)θ橄侔┑牧馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移治療提供新的思路。

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