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    根用芥菜花藥培養(yǎng)技術體系研究

    2012-01-05 01:46:23向極釬汪李平殷紅清
    關鍵詞:胚率花藥培養(yǎng)胚狀體

    王 萌,向極釬,汪李平,殷紅清,馬 進

    (1.恩施清江生物工程有限公司,湖北 恩施 445000;2.華中農業(yè)大學 園藝林學學院,湖北 武漢 430070)

    根用芥菜(Brassicajunceavar.megarrhizaTsen et Lee)又名大頭菜,屬我國特產蔬菜.我國大頭菜育種相對比較落后,嚴重地制約著生產的發(fā)展.利用花藥培養(yǎng)技術可以加速育種進程.花藥培養(yǎng)技術發(fā)展迅速,特別是在十字花科作物上,已成為重要的育種手段,而在根用芥菜上,相關的研究很少[1-2].

    本研究旨在探索根用芥菜花藥培養(yǎng)過程中最適培養(yǎng)基、激素、預冷時間、熱激時間等,建立其較為完善的花藥培養(yǎng)胚狀體誘導體系,從而獲得DH系,加速育種進程.

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    本試驗以著名地方品種-襄樊獅子頭芥菜(大頭菜)為材料.采取常規(guī)栽培管理,株現(xiàn)蕾后,摘取健壯無病蟲的花蕾進行試驗.丟棄有病、有蟲、畸形、開裂、柱頭外露的花蕾,去除過大和過小的花蕾,花序上僅保留2.0~3.0 mm長度的花蕾(小孢子處于單核靠邊期見封二圖版4).將處理好的花序用濕紗布包裹放入培養(yǎng)皿中,置于4℃冰箱.

    1.2 試驗方法

    將處理好的花序先在自來水下沖洗30 min,在超凈工作臺上,依次使用 75%的酒精滅菌30 s,0.1%的升汞滅菌10 min,無菌水清洗3次.在無菌濾紙上用尖頭鑷子輕輕剝開花蕾,取出花藥,接種于培養(yǎng)基上,蓋上培養(yǎng)皿,用parafilm膜封口.剝取花藥時要盡量少傷及花藥,盡量不要帶花絲.在隔水式恒溫培養(yǎng)箱中進行熱激處理一定的時間后,轉入25℃條件下黑暗靜置培養(yǎng),4周后統(tǒng)計胚狀體誘導率.培養(yǎng)基瓊脂含量為0.8%,pH5.8,121℃高溫濕熱滅菌[3].

    1.2.1 不同培養(yǎng)基對出胚率的影響 不同的培養(yǎng)基在花藥培養(yǎng)試驗中報道結果不一,而且花藥培養(yǎng)成功的報道相對較多.而在大頭菜游離小孢子培養(yǎng)上報道較少,花藥培養(yǎng)尚未見報道.所以本實驗選用在十字花科作物上使用較多的MS、B5和改良的Keller培養(yǎng)基[4-6].其中MS、B5的蔗糖濃度為6%,改良Keller蔗糖濃度為10%[7].

    1.2.2 激素對出胚率的影響 將花藥接種于添加1 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的Keller-10培養(yǎng)基中,以不添加激素的Keller-10為對照[8],4周后統(tǒng)計不同處理間胚狀體誘導率的差異.

    1.2.3 預冷天數對出胚率的影響 將挑選好的花序用濕紗布包好放入4℃的冰箱進行預冷處理,處理天數分別為0、1、3、5 d,達到預定時間后取出進行花藥培養(yǎng),以不進行預冷處理為對照.

    1.2.4 熱激天數對出胚率的影響 花藥接種后放入32.5℃恒溫箱中進行熱激處理,熱激處理處理時間分別為0、1、2 d,處理結束后轉入25℃恒溫箱中進行黑暗培養(yǎng).

    上述試驗的每個處理中,平均每個培養(yǎng)皿接種4個花蕾,每個處理10皿,兩次重復.

    表1 不同培養(yǎng)基對花藥胚胎發(fā)生的影響

    表2 激素對花藥胚胎發(fā)生的影響

    表3 預冷天數對花藥胚胎發(fā)生的影響

    2 結果與分析

    2.1 培養(yǎng)基對出胚率的影響

    本試驗中,MS-6和B5-6兩種培養(yǎng)基上沒有獲得胚狀體,由表1得出結論,Keller-10培養(yǎng)基更適合進行大頭菜的花藥培養(yǎng).實驗中我們觀察到,當花藥從花蕾中剝出時,花藥呈黃綠色,接種后3 d左右,花藥變?yōu)榱咙S色,稍微膨大,多數花藥有明顯的彎曲現(xiàn)象;隨后花藥的顏色慢慢變?yōu)辄S褐色至褐色.大約3周后,某些花藥上會有白色的針狀物刺破花藥壁鉆出,這些就是子葉胚的雛形,子葉胚自胚根伸出后發(fā)育較快,約一周的時間就可看到完整的子葉胚(見封二圖版5).

    2.2 激素對出胚率的影響

    由表2可以得出在添加激素的培養(yǎng)基中無胚狀體產生,Keller-10培養(yǎng)基不添加激素更適合進行大頭菜花藥培養(yǎng).在實驗中發(fā)現(xiàn),添加激素的培養(yǎng)基中,帶有花絲的花藥多數都有膨大現(xiàn)象,另外,在花藥上特別是花藥與花絲的斷口處,常常形成一團白色半透明的愈傷組織,在接種的初期,愈傷生長很快,到后期慢慢褐化死亡.

    2.3 預冷天數對出胚率的影響

    由表3可以得出4℃處理5 d與處理3 d在對胚狀體的誘導上存在顯著差異,處理5 d的誘導率最低,預冷0、1、3 d三種處理之間在出胚總數和出胚率上存在差異,但是這種差異沒有達到顯著水平,所以4℃低溫處理花序0、1、3 d都有較好的出胚率,低溫處理3 d時,出胚率最高.

    2.4 熱激天數對出胚率的影響

    熱激處理的目的在于從外界給予花藥內的小孢子一種刺激,促使它的發(fā)育途徑偏轉,由配子體發(fā)育轉到孢子體發(fā)育途徑上.在不同的物種,不同的種、品種間最適的熱激的時間都不太一致,但多數認為熱激處理是有效的.由表4可以看出,在本試驗中也得出相似的結論,32.5℃熱激處理1、2 d與不進行熱激處理之間在出胚誘導上存在顯著差異,熱激處理1 d和2 d之間沒有顯著差異,但熱激處理2 d稍好.

    表4 熱激天數對花藥胚胎發(fā)生的影響

    3 結論與討論

    通過比較MS、B5和改良Keller三種培養(yǎng)基對出胚率的影響,得出改良Keller更適合根用芥菜花藥培養(yǎng).在試驗中觀察到MS-6和B5-6培養(yǎng)基上接種的花藥與在Keller-10上培養(yǎng)的花藥相比,沒有明顯的不同,這可能是花藥內的小孢子沒有脫分化或者脫分化后發(fā)育在某個階段停止,沒有刺破花藥壁鉆出.另外還觀察到如果接種的花藥帶有花絲,則很多花藥膨大很明顯(見封二圖6~7),甚至在花藥的某個部位劇烈膨漲,呈半透明狀,這些花藥最終褐化死亡,沒有胚狀體產生,所以在接種時盡量去掉花絲.改良Keller與其他兩種培養(yǎng)基最明顯的差別在于Keller配方中大量元素的含量低,有機成分含量很高,在試驗中,三種培養(yǎng)基在蔗糖濃度上也有較大差別,出胚率的差異是由哪個因素造成還有待進一步研究.

    通過比較不同預冷時間對花藥培養(yǎng)過程中出胚率的影響,得出4℃處理花蕾3 d最好,這一結果與前人的研究結果比較一致.4℃處理3 d出胚率最高,但3 d內對出胚率的影響差異不大,所以低溫處理更實際的用途在于暫時保存花蕾,低溫處理時間超過5 d,花蕾萎蔫對出胚不利.

    通過比較是否添加6-BA和NAA對出胚率的影響,得出激素的添加不利于花藥的出胚,這可能與添加的激素種類、濃度不合適有關,也可能是由于激素的添加導致體細胞增殖,消耗了營養(yǎng)物質和花藥本身的內源物質,抑制了小孢子的脫分化或發(fā)育進而影響了出胚.激素對出胚率的影響還有待進一步研究.

    [1] 陳玉萍,田志宏,陳愛武,等.包心芥菜游離小孢子培養(yǎng)的初步研究[J].華中農業(yè)大學學報,1998,17(1):97-99.

    [2] 劉冬,郭平仲,劉凡,等.芥菜(Brassica juncea L.)小孢子胚發(fā)生和植株再生[J].首都師范大學學報:自然科學版,1997,18(1):79-84.

    [3] 王濤濤.蕓薹屬蔬菜小孢子培養(yǎng)及自交不親和性的分子鑒定[D].武漢:華中農業(yè)大學,2006.

    [4] 宋寶香,馮輝,楊春喜.基本培養(yǎng)基和蔗糖濃度在大白菜花藥培養(yǎng)中對胚狀體誘導的影響[J].中國農學通報,2006,21(11):45-46.

    [5] 王超楠,馮輝,姜鳳英,等.羽衣甘藍花藥培養(yǎng)胚狀體誘導初報[J].中國蔬菜,2006(6):23-24.

    [6] 許忠民,張恩慧,歐承剛,等.不同因素對甘藍花藥愈傷組織誘導的影響[J].西北農林科技大學學報:自然科學版, 2006,34(9):71-74.

    [7] 梅時勇,楊保國,姚芳,等.蘿卜花藥培養(yǎng)試驗[J].中國蔬菜,2002(1):35-36.

    [8] 袁惠燕,侯喜林.溫度預處理對不結球白菜雜種F1花藥培養(yǎng)[J].南京農業(yè)大學學報,2008,31(4):144-148.

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