葉綠酸鐵與環(huán)糊精包合性質(zhì)的初步研究

孫俊梅，曾建，任勇

(1.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川 成都 610106；2.南京師范大學(xué)江蘇省醫(yī)藥超分子材料及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210097)

葉綠酸合鐵(簡(jiǎn)稱葉綠酸鐵或鐵葉綠酸)是葉綠素的金屬螯合物，結(jié)構(gòu)與人體血紅素相似；其可溶性鈉鹽是中藥生血寧的主要有效成分，機(jī)體吸收后可促進(jìn)血紅蛋白再生和補(bǔ)充機(jī)體鐵元素，是治療缺鐵性貧血的良好藥物.葉綠酸鐵鈉溶液pH高，稀釋后易水解而析出難溶的酸型葉綠酸鐵沉淀，溶液中及固體制劑的光、熱穩(wěn)定性皆較差，影響產(chǎn)品質(zhì)量.因此提高酸型葉綠酸鐵溶解性和穩(wěn)定性，對(duì)改進(jìn)生血寧產(chǎn)品具有重要意義.環(huán)糊精(CD)是葡糖糖殘基以α-1，4糖苷鍵連接而成的環(huán)狀化合物.CD具有“外親水內(nèi)疏水”的特點(diǎn)，可形成包合物改善客體分子的溶解度、溶出速度、穩(wěn)定性和生物利用度等性質(zhì).常用天然CD有α-CD、β-CD、γ-CD.

本文中依據(jù)藥物結(jié)構(gòu)特性研究了葉綠酸鐵與α-、β-和γ-CD的包合作用，表明包合技術(shù)對(duì)葉綠酸鐵的性質(zhì)具有良好的改進(jìn)作用，其研究目前尚少見(jiàn)報(bào)道.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑Explorer電子分析天平(Ohaus Corporation USA)，UV-2450型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)，KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，葉綠酸鐵(江蘇省醫(yī)藥超分子材料及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)，β-環(huán)糊精(上?；瘜W(xué)試劑公司，重結(jié)晶2次)，α-環(huán)糊精(廣州Maxdragon公司)，γ-環(huán)糊精(廣州Maxdragon公司)，pH 6.86磷酸緩沖鹽(上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司).

1.2包合常數(shù)的測(cè)定[1-3]取pH 6.86磷酸鹽緩沖液(25 mmol/L)配制一定濃度的葉綠酸鐵溶液A，取溶液A配制CD的濃溶液B.取A液2.5 mL進(jìn)行紫外掃描，依次向體系中加入20 μL的B液，記錄體系紫外吸光度的變化.以1/ΔA對(duì)1/[CD] 作圖，通過(guò)回歸直線的斜率和截距可求得CD與葉綠酸鐵的表觀一級(jí)包合常數(shù)Ka.其中ΔA為加入CD后體系紫外吸光值的變化，[CD]為體系中CD的濃度.

1.3包合物的制備[4]采用研磨法制備包合物.精密稱取葉綠酸鐵以5倍量乙醇溶解，取3倍摩爾比的CD加入適量pH 6.86 磷酸鹽緩沖液和葉綠酸鐵乙醇溶液，常溫錫箔紙避光研磨，至粘稠的糊狀后室溫真空干燥得固體包合物.

1.4 溶解性質(zhì)研究

圖1 葉綠酸鐵溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 取含10%乙醇的pH 6.86磷酸鹽緩沖液配制適當(dāng)濃度葉綠酸鐵溶液，200～500 nm區(qū)間掃描顯示葉綠酸鐵在398.5 nm 有強(qiáng)紫外吸收峰且該波長(zhǎng)下CD無(wú)吸收，故選擇該波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng).

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密稱取葉綠酸鐵10 mg于200 mL容量瓶，加入20 mL無(wú)水乙醇超聲使其溶解，取pH 6.86磷酸鹽緩沖液稀釋并定容得母液；分別量取母液并用相同緩沖液稀釋成8.0 ～ 36.0 μg/mL 系列濃度測(cè)試液，測(cè)定并記錄398.5 nm吸光度，以吸光度(A)對(duì)濃度(C)作圖(圖1)，線性回歸得標(biāo)準(zhǔn)方程：A=0.019 9C-0.003 1 (r=0.999 9).

1.4.3 溶出度和溶解度 分別取葉綠酸鐵原料及相應(yīng)量β-CD包合物置于50 mL燒杯，加入20 mL pH 6.86磷酸鹽緩沖液，震蕩2 min觀測(cè)溶解速度，濾取溶液測(cè)定吸光度；另取樣品避光超聲30 min后靜置5 h，濾取濾液稀釋后測(cè)定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得葉綠酸鐵溶解度.

1.5樣品溶液光穩(wěn)定性的研究取pH 6.86磷酸緩沖鹽配制濃度40 μg/mL的葉綠酸鐵溶液或包合物溶液，測(cè)定各樣品吸光度A0，然后分別裝于3只具塞試管，分別置于恒溫棕色干燥器，1 000 lx 和4 000 lx光照箱，設(shè)定時(shí)間點(diǎn)分別取樣，測(cè)定葉綠酸鐵的含量或殘留率，通過(guò)曲線回歸推算藥物的半衰期.

1.6固體樣品熱穩(wěn)定性取葉氯酸鐵及CD 包合物固體少許，測(cè)定含量后(0 d)于40 ℃溫度下放置10 d，分別在5 d 和10 d 檢測(cè)樣品中葉氯酸鐵的含量.

2 結(jié)果及討論

表1 葉綠酸鐵與CD的Ka及回歸方程(398.5 nm)

2.1Ka的測(cè)定CD與客體分子的包合是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，包合物形成后，客體分子的吸收光譜產(chǎn)生位移或吸光強(qiáng)度發(fā)生改變.根據(jù)吸光度隨CD濃度的變化可求得Ka(表1)，Ka值越大越易形成穩(wěn)定的包合物.

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葉綠酸鐵的紫外吸光度隨著CD濃度的增大而增大，說(shuō)明二者之間發(fā)生包合作用.另從表1可知，葉綠酸鐵與CD的Ka為7.9～2 869.8 L/mol，呈現(xiàn)β-CD>α-CD >γ-CD的規(guī)律，表明β-CD與葉綠酸鐵包合效果最好.

圖2 葉綠酸鐵結(jié)構(gòu)及分子尺寸

葉綠酸鐵分子結(jié)構(gòu)如圖2所示，采用ChaChe WorkSystem Pro.(6.1.8) 分子模擬系統(tǒng)計(jì)算葉綠酸鐵分子各基團(tuán)間距及CD內(nèi)腔大小見(jiàn)表2.

由表2可知，葉綠酸鐵分子母核兩端原子間距較大，不易進(jìn)入CD疏水內(nèi)腔，其支鏈a空間為0.352 1 nm小于CD內(nèi)徑，是形成包合的主要部位.β-CD的空腔內(nèi)徑與葉綠酸鐵支鏈空間基本適合，易于發(fā)生相互作用而形成穩(wěn)定的包合物；而α-CD由于環(huán)的內(nèi)徑較小，匹配作用稍差而弱于β-CD的包合；γ-CD較大的空腔，疏水作用減弱包合松散，其作用力不足以使葉綠酸鐵與γ-CD以穩(wěn)定的包合物形式存在.

表2 CD與葉綠酸鐵的計(jì)算機(jī)分子模擬結(jié)果

由于β-CD包合葉綠酸鐵具有最大的Ka，所以進(jìn)一步制備β-CD-葉綠酸鐵包合物，考察β-CD對(duì)葉綠酸鐵溶解度和光、熱穩(wěn)定性的影響，探索β-CD包合葉綠酸鐵的改進(jìn)效果及技術(shù)可行性.

2.2溶解性能研究測(cè)定結(jié)果顯示，葉綠酸鐵固有溶解度為81.6 μg/mL，但震蕩2 min幾乎不溶解(<8.0 μg/mL)；β-CD包合物震蕩即快速分散溶解、溶液顏色迅速加深，2 min溶出量35.1 μg/mL；包合物溶液平衡后溶解度114.9 μg/mL，為葉綠酸鐵溶解度的140%，表明β-CD對(duì)改善葉綠酸鐵溶解度尤其是溶出度具有明顯效果.

2.3光穩(wěn)定性的研究表3為試驗(yàn)條件下溶液中各樣品降解半衰期(T1/2).由表可知，避光條件下，樣品β-CD對(duì)葉綠酸鐵的作用導(dǎo)致穩(wěn)定性略有下降，T1/2稍短于原料藥，然而隨著光照強(qiáng)度的增大，各樣品分解的T1/2均逐漸減小(穩(wěn)定性降低)，但包合態(tài)葉綠酸鐵的T1/2減小幅度顯著弱于原料藥，β-CD的穩(wěn)定性增強(qiáng)效果明顯.說(shuō)明葉綠酸鐵與β-CD形成的包合物有利于增強(qiáng)葉綠酸鐵的光穩(wěn)定性.

2.4熱穩(wěn)定性的研究40 ℃條件下，5 d后葉綠酸鐵及包合物的藥物相對(duì)含量分別從0 d的100%降至58.4%和73.9%，10 d后進(jìn)一步降到36.6%和52.3%；葉綠酸鐵包合物含量均明顯高于葉綠酸鐵原料.由此說(shuō)明，CD包合使葉綠酸鐵的熱穩(wěn)定性得到明顯提高，有利于延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期.

表3 試驗(yàn)條件下樣品光穩(wěn)定性的半衰期 h

3 小結(jié)

本文中通過(guò)研究系列CD與葉綠酸鐵的Ka，探索CD包合葉綠酸鐵的可能性，選擇Ka較大的β-CD制得穩(wěn)定的包合物，通過(guò)樣品溶解性和光熱穩(wěn)定性測(cè)定證明包合技術(shù)對(duì)改進(jìn)葉綠酸鐵藥學(xué)性質(zhì)具有可行性.該結(jié)果對(duì)深入研究開(kāi)發(fā)新型葉綠酸鐵補(bǔ)血制劑提供了重要的技術(shù)基礎(chǔ).

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