大鼠肺成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)及急性炎癥模型的建立

朱天琦，鄭聲星

（1.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325027）

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是臨床常見(jiàn)危重病，其病死率極高，大約在40%～70%，由內(nèi)毒素血癥引起的ARDS極為常見(jiàn)。成纖維細(xì)胞作為間質(zhì)的主要成分，其對(duì)炎癥的成功消退過(guò)程起到了重要的作用。而在體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞并建立其急性炎癥模型是研究成纖維細(xì)胞在ARDS過(guò)程中促炎癥消退作用的重要方法之一。本研究用不同劑量的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激體外培養(yǎng)的肺成纖維細(xì)胞（lung fiibroblasts，LF），并在不同時(shí)間點(diǎn)通過(guò)細(xì)胞毒性檢測(cè)來(lái)評(píng)價(jià)內(nèi)毒素性細(xì)胞的損傷程度，旨在建立合理的體外細(xì)胞ARDS模型。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)健康Sprague Dawley（SD）雄性大鼠60只，體質(zhì)量120～150 g，平均（132±10）g由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（醫(yī)動(dòng)字第19-025號(hào)）。

1.2 主要試劑 內(nèi)毒素（LPS，E.coil serotype 055：B5），細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)試劑（MTT）為3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，購(gòu)自美國(guó)sigma公司。用超純水溶解的H-DMEM的培養(yǎng)基（Gibco公司），消化液:0.25%胰蛋白酶（Sigma公司）?？共ㄐ蔚鞍祝╲imentin）單克隆抗體和CD31單克隆抗體，均購(gòu)自abcam公司。

1.3 LF的分離、培養(yǎng) 參照Tamm等[1]的組織貼壁方法并進(jìn)行改良，大鼠稱重，腹腔注射2%戊巴比妥鈉80 mg/kg麻醉，仰臥位固定。沿腹中線剪開(kāi)皮膚、皮下組織，暴露腹腔，切斷腹主動(dòng)脈放血，剪掉橫膈膜，暴露胸腔，截取胸骨，小心折斷肋骨，摘除胸腺，最大限度地暴露心臟及大血管，從右心室插入套管至肺動(dòng)脈，用D-Hanks液灌洗至肺明顯發(fā)白，完整地取出心肺氣管，除去心臟和大氣道，置于放有預(yù)冷的D-Hanks（青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 IU/mL）的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，反復(fù)用預(yù)冷的D-Hanks液沖洗，用小剪刀將肺組織剪碎（<1 mm3) ，移至10 mL離心管中， 靜置5 min后，吸去D-Hanks液后加入0.25%胰蛋白酶（37 ℃預(yù)溫）5 mL，用吸管反復(fù)吹打1.5 min，加入含15%新生牛血清（NBS）的H-DMEM培養(yǎng)液終止消化，用吸管吹打均勻，1000 r/min離心5 min，棄上清，再加入少量15% NBS HDMEM懸浮組織塊，加入培養(yǎng)液以不飄起組織塊為宜。每只大鼠肺可接種一個(gè)25 mL的培養(yǎng)瓶。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h補(bǔ)加培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)，72 h換液。4 d細(xì)胞接近融合時(shí)，棄去培養(yǎng)液，D-Hanks液輕洗3次，加入0.25%胰酶消化1 min，用含15%NBS的H-DMEM培養(yǎng)液終止消化， 吸管輕輕吹打細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液， 1000 r/min離心2 min，棄上清，用15% NBS的H-DMEM培養(yǎng)液，按1:2接種傳代，40 min后換培養(yǎng)液（差速貼壁法）。LF細(xì)胞采用HE染色。

1.4 免疫熒光鑒定 將傳代的LF消化制成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/mL，接種于6孔板內(nèi)（孔內(nèi)有預(yù)先置有多聚賴氨酸涂布的蓋玻片），37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿蓋玻片時(shí)，取出蓋玻片，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，含0.2% Triton的PBS洗兩次，再PBS洗兩次，5% BSA封閉40 min（室溫），保持濕度，抗孵育過(guò)夜（4 ℃）。次日用PBS洗3次，每次5 min，加二抗（避光）室溫孵育1 h，PBS洗7次，每次5 min，Hoechest復(fù)染核12 min，PBS洗1次，檢測(cè) LF vimentin和CD31的表達(dá)。

1.5 MTT 將分離純化的LF用含15% NBS的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，接種入6孔板，2 mL/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞80%～90%呈融合狀態(tài)時(shí)，換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后重懸，調(diào)整濃度為1×106個(gè)/mL，加入96孔板，100μL/孔，5復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照孔（不加細(xì)胞），加入不同濃度LPS作為刺激物，建立體外炎癥模型，同時(shí)以PBS作為陰性對(duì)照。藥物干預(yù)時(shí)間分別設(shè)為3、6和9 h，至規(guī)定時(shí)間后加入MTT，每孔加MTT溶液（5 mg/mL用PBS配制，pH=7.4）20μL。繼續(xù)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150μL DMSO，震蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。放入酶標(biāo)儀檢測(cè)，測(cè)定波長(zhǎng)490 nm各孔的OD值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。所有數(shù)據(jù)以±s表示，多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因數(shù)方差分析。方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進(jìn)行Dunnet’s T3檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 LF的分離純化和擴(kuò)增 24 h后顯微鏡下可見(jiàn)長(zhǎng)梭型細(xì)胞從組織塊中爬出， 72 h后細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，4 d接近融合。在原代培養(yǎng)過(guò)程中，LF還混有少量的圓形II型肺泡上皮（alveolar typeII，ATII）（見(jiàn)圖1），因?yàn)閭鞔蟛町愘N壁，利用成纖維細(xì)胞貼壁的時(shí)間早于ATII細(xì)胞，從而去除ATII細(xì)胞。LF呈星狀或梭形，核橢圓形，核仁明顯，細(xì)胞伸出多個(gè)突起，并連接成網(wǎng)狀。傳代后的LF幾乎長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)瓶，偶見(jiàn)其他非纖維細(xì)胞（見(jiàn)圖2），細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，3 d接近融合，連續(xù)傳4～5代以后，細(xì)胞增殖能力方逐漸下降。

2.2 免疫熒光 肺成纖維細(xì)胞vimentin陽(yáng)性，CD31陰性（見(jiàn)圖3）。

圖1 原代細(xì)胞（HE，×200）

圖2 傳代第三代細(xì)胞（HE，×200）

圖3 LF vimentin 陽(yáng)性，CD31陰性

2.3 MTT檢測(cè)結(jié)果 在LPS的刺激下，大鼠肺成纖維細(xì)胞出現(xiàn)了增殖反應(yīng)，0.1μg/mL組、1μg/mL組、10μg/mL組與對(duì)照組相比，均出現(xiàn)了增殖反應(yīng)（P<0.05）。其中刺激濃度為1μg/mL時(shí)，與其他3組相比，細(xì)胞增殖反應(yīng)最大（P<0.05），且在各個(gè)濃度的不同刺激時(shí)間里，6 h時(shí)，細(xì)胞增殖反應(yīng)較大（P<0.05），具體見(jiàn)表1。因此可以確定LPS刺激致ARDS模型的最適刺激濃度為1μg/mL，最佳刺激時(shí)間為6 h。

表1 各組不同時(shí)間段OD值比較（±s）

表1 各組不同時(shí)間段OD值比較（±s）

與其他各組比：aP<0.05；與3h、9h比：bP<0.05

3h 0.206±0.008 0.323±0.007 0.372±0.044a 0.348±0.069組別對(duì)照組0.1μg/mL 1μg/mL 10μg/mL 6h 0.199±0.009 0.337±0.009 0.439±0.012ab 0.362±0.009 9h 0.207±0.010 0.337±0.011 0.383±0.007a 0.351±0.011

3 討論

成纖維細(xì)胞是人體數(shù)量最多的一種間質(zhì)細(xì)胞[2]，主要功能包括細(xì)胞外基質(zhì)的合成與重造、調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的分化、調(diào)節(jié)炎癥過(guò)程以及參與組織損傷的修復(fù)[3]。通過(guò)調(diào)控成纖維細(xì)胞可以調(diào)控炎癥的發(fā)生及消退過(guò)程。

本試驗(yàn)參照Tamm等[1]的組織貼壁方法分離肺成纖維細(xì)胞，并進(jìn)行改良。在分離細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，分離前使用肝素和經(jīng)肺動(dòng)脈、經(jīng)氣道的充分灌洗非常重要。充分灌洗能沖走心臟和大血管里的大部分血細(xì)胞和肺泡內(nèi)絕大多數(shù)的巨噬細(xì)胞，這樣可以增加成纖維細(xì)胞的純度。而本實(shí)驗(yàn)采用胰酶稍微消化后的組織混合懸液進(jìn)行貼壁培養(yǎng)的方法，與單純組織培養(yǎng)法[4]相比，單純組織貼壁法缺點(diǎn)為組織存活率低，而且成纖維細(xì)胞爬出慢，至少要兩周左右才能有成纖維細(xì)胞爬出。同時(shí)與差速離心和貼壁法[5]相比，差速離心和貼壁法缺點(diǎn)為酶消化法步驟多，過(guò)程復(fù)雜，極易污染，成功率很低，而且多次離心也會(huì)使細(xì)胞損傷和丟失。另外本實(shí)驗(yàn)基本上2代的成纖維細(xì)胞純度可達(dá)95%～99%。差異貼壁利用成纖維細(xì)胞貼壁的時(shí)間早于ATII細(xì)胞，從而去除ATII細(xì)胞。本方法操作簡(jiǎn)單， 大大縮短了時(shí)間， 全程大約為1 h，減少了污染機(jī)會(huì)，保證了細(xì)胞活力（與組織塊培養(yǎng)法[4]、差速離心和貼壁法[5]相比）。 本實(shí)驗(yàn)還觀察到培養(yǎng)瓶中組織塊分布的均勻度及培養(yǎng)基的量對(duì)于成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)有很大影響，組織塊必須分布均勻而且培養(yǎng)基的量一定要避免組織塊飄起為準(zhǔn)。

炎癥是機(jī)體抵抗病原入侵、修復(fù)組織細(xì)胞損傷的重要防御機(jī)制之一。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為急性炎癥效應(yīng)細(xì)胞主要有白細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等，目前越來(lái)越多證據(jù)表明成纖維細(xì)胞也可以作為急性炎癥效應(yīng)細(xì)胞[6]。但至今國(guó)內(nèi)外鮮有理想的在體外培養(yǎng)的LF上建立急性炎癥模型。在70%的臨床ARDS病人中，40%與感染及膿毒血癥有關(guān)，而細(xì)菌內(nèi)毒素作為自然的致病原是引起ARDS的重要因素[7]。本實(shí)驗(yàn)選擇LPS建立急性炎癥模型較為合理。

MTT可用于簡(jiǎn)便而較準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖分析，MTT比色法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖分析。本試驗(yàn)是在分離純化得到的成纖維細(xì)胞上直接用LPS干預(yù)，并利用MTT來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖高峰所需的LPS的濃度及達(dá)到增殖高峰的時(shí)間，結(jié)果顯示在體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞上用1μg/mL的LPS干預(yù)6 h能夠達(dá)到增殖的最高峰。本實(shí)驗(yàn)采用原代成纖維細(xì)胞建立模型較能表現(xiàn)成纖維細(xì)胞病理生理特性，但缺點(diǎn)是LPS直接干預(yù)下原代成纖維細(xì)胞與在體LPS干預(yù)下LF還是有一定區(qū)別，因?yàn)槠洳荒茱@現(xiàn)出成纖維細(xì)胞與肺巨噬細(xì)胞等的相互作用過(guò)程。我們下一步的研究為避免這樣缺點(diǎn)，將采用LPS刺激大鼠，建立大鼠急性肺損傷，并應(yīng)用免疫磁珠方法急性分離LF，建立急性炎癥LF模型。

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