大鼠出生后早期心肌細胞有絲分裂指數(shù)檢測及細胞周期進程相關(guān)基因的表達

曠文安，黃偉聰，王玨，楊凱，鄭哲，孫成超

（1.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 心胸外科，浙江 溫州 325000；2.北京阜外心血管病醫(yī)院 衛(wèi)生部再生醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100037）

最新的實驗研究表明，哺乳動物心臟在出生后早期存在心肌細胞的分裂增殖[1]，而對于成熟的心肌細胞，在特定的條件下仍然可以被誘導(dǎo)重新進入細胞周期，并以增生性生長為主的方式改善心臟功能[2]。心肌細胞的增殖依賴于心肌細胞的有絲分裂，Ccnd1、Ccna2、Ccnb1、Cdc2、CDk2、Cdk4、Cdkn1a和Cdkn1b等細胞周期進程相關(guān)基因的表達與心肌細胞的有絲分裂密切相關(guān)[3-4]。組蛋白H3的磷酸化貫穿于有絲分裂分裂期（M期）的各個時相[5]，是目前標(biāo)記細胞有絲分裂的最佳指標(biāo)之一，且廣泛用于心肌細胞的增殖研究中[1，6]。本實驗應(yīng)用RT-PCR的方法定量檢測細胞周期相關(guān)基因在大鼠出生后早期不同時間點的表達情況，并以磷酸化組蛋白3（H3p）和肌鈣蛋白T（cTnt）雙重免疫熒光染色各時間點的心室肌組織，檢測其有絲分裂指數(shù)，在細胞和組織水平共同研究大鼠出生后早期心肌細胞的增殖情況。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 出生后第1、4、7、10、14天的SD大鼠由溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，研究經(jīng)溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、PBS、青鏈雙抗、胰蛋白酶（北京四環(huán)生物有限公司），胎牛血清FBS（美國Gibco公司），H3p小鼠IgG單克隆抗體（美國millipore公司），cTnt抗體（英國Abcam公司），DAPI染色劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PromegaA3500（美國Promega公司），引物設(shè)計與合成（北京六合通生物技術(shù)公司）：Gapdh（F：5’-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’，R：5’-ATGGTGG TGAAGACGCCAGTA-3’）；Ccnd1（F：5’-TACCGCACAACGCA CTTTC-3’，R：5’-AAGGGCTTCAATCTGTTCCTG-3’）；Ccna2（F：5’-GCCATCGCTTATTGCTGGAG-3’，R：5’-CTTTGAGGTAGGTCTGGTGAAGGTC-3’）；Ccnb1（F：5’-GGTGGAACTGGATGAGCCTGA-3’，R：5’-TGTTTCCATTGGGC TTGGAGA-3’）；Cdk1（F：5’-TCCCTGCAGGACTACAAGAA CAC-3’，R：5’-GATTCGTTTGGCTGGATCATAGAC-3’）；Cdk2（F：5’-CCTGCACCAGGACC TCAAGAA-3’，R：5’-CGGTGAGAATGGCAGAATGCTA-3’）；Cdk4（F：5’-TAAAGGGCCACCTCCGCAGC-3’，R：5’-AAAGGCAGCCCCTCT CCTCACT-3’）；Cdkn1a（F：5’-CACGGCTCAGTGGACCAG AA-3’，R：5’-ACTGGAGCTGCCTGAGGTAGGA-3’）；Cdkn1b（F：5’-CGAATGCTGGCACTGTGGA-3’，R：5’-CATTCAAT GGAGTCAGCGATATGTA-3’）。

1.3 主要儀器設(shè)備 細胞培養(yǎng)超凈臺GB-II（北京長城空氣凈化設(shè)備公司），CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），realtime-PCR儀7300（美國AB公司），熒光顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 原代心肌細胞分離與純化：無菌條件下開胸取出生后第1、4、7、10、14天的大鼠心臟，PBS沖洗殘留血漬，剪碎心室肌組織，約1 mm3，然后用事先配好的消化液（trypsin 0.080%，Nacl 0.801%，Kcl 0.030%，NaHCO30.035%，Glucose·H2O 0.099%，pH 7.4）消化約12～16次（37 ℃，8 min/次）。將消化的細胞懸液離心后，加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)70 min后，收集細胞懸液再次離心后，加入含10% FBS和1% Brdu的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，離心收集心肌細胞并加入Trizol試劑，-80 ℃保存。

1.4.2 心肌細胞RNA提取及qRT-PCR定量檢測：收集大鼠的原代心肌細胞，Trizol法提取總RNA，Sbyegreen法逆轉(zhuǎn)錄cDNA后在realtime-PCR儀7300上行定量PCR，以GAPDH為內(nèi)參，利用2-ΔΔCt方法計算不同時間點心肌細胞Ccnd1、Cdk1和Cdkn1a等基因的mRNA表達水平。

1.4.3 心室肌組織免疫熒光雙重染色：開胸取出生后第1、4、7、10、14天的大鼠心臟，PBS沖洗殘留血漬，10%的中性甲醛液固定，制備石蠟切片，脫蠟脫水后，孵育H3p抗體（1:100）、cTnt抗體（1:1000）及二抗顯色，DAPI顯示細胞核。

1.4.4 熒光顯微鏡觀察并拍照：應(yīng)用Olympus BX61正置熒光顯微鏡，在400倍視野分別觀察激發(fā)波長480 nm下H3P的表達，紫外光區(qū)DAPI的細胞核染色，以及在激發(fā)波長560 nm處觀察cTnt的表達，通過分析軟件拍照，并將三者圖像通過3D疊加以確定三者共表達的細胞。每個時間點8張切片，每張切片隨機拍下10個視野。

1.4.5 細胞計數(shù)：ImageJ軟件計數(shù)每個400倍視野中H3P-cTnt-DAPI共表達細胞數(shù)與總心肌細胞數(shù)，二者的比值，即為心肌細胞的有絲分裂指數(shù)（mitotic index，MI）。

2 結(jié)果

2.1 大鼠出生后早期不同時間點的心肌細胞有絲分裂指數(shù) 通過對大鼠生后第1、4、7、10、14天心室肌組織H3P（綠色）-cTnt（紅色）-DAPI（藍色）的多重免疫熒光染色（見圖1），我們可以清晰分辨出心肌細胞的有絲分裂相。數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示（見圖2）：出生后第1、4、7、10天大鼠心室肌組織MI分別為1.884%±0.118%、2.744%±0.183%、1.025%±0.053%和0.086%±0.012%。出生后第4天時心肌細胞有絲分裂指數(shù)出現(xiàn)峰值，約為第1天時的1.5倍（P＜0.05），第10天時，有絲分裂指數(shù)急劇下降，僅為第4天時的0.03倍（P＜0.05），出生后第14天的大鼠心臟卻未發(fā)現(xiàn)有絲分裂的心肌細胞。

圖1 大鼠出生后不同時間點心肌組織的雙重免疫熒光染色（×400）

圖2 大鼠出生后第1、4、7、10、14天時心肌細胞有絲分裂指數(shù)

2.2 大鼠出生后不同時間點的心肌細胞周期相關(guān)基因的mRNA表達水平 qRT-PCR法檢測出生后第1、4、7、10、14天SD大鼠心肌細胞中細胞周期進程相關(guān)基因的mRNA表達水平，數(shù)據(jù)顯示：出生后第4天心肌細胞Ccnd1、Ccna2、Ccnb1、Cdk1、CDk2和Cdk4出現(xiàn)表達高峰，然而在出生后第10天的心肌細胞中表達急劇下降，出生后第14天表達水平更低，而Cdkn1a、Cdkn1b的表達水平隨著大鼠日齡的增加呈遞增趨勢（見圖3）。

3 討論

心肌細胞的分裂增殖源于有絲分裂的完成，H3p是目前研究心肌細胞有絲分裂增殖的最佳標(biāo)志之一。通過對心肌細胞有絲分裂指數(shù)的檢測，我們發(fā)現(xiàn)大鼠出生后第4天時，細胞有絲分裂指數(shù)到達峰值，之后第10天時則急劇下降，直至第14天時檢測不到。綜上結(jié)果，我們認(rèn)為出生后第4天和第10天是大鼠心肌細胞增殖的拐點。Soonpaa等[7]研究認(rèn)為小鼠出生后4～6 d心肌細胞DNA的合成高峰與心肌細胞的雙核化一致，并推測此時只有心肌細胞核分裂而沒有胞質(zhì)分裂。但最近Porrello等[1]研究卻發(fā)現(xiàn)小鼠在出生后7 d心肌細胞仍具有完成胞質(zhì)分裂的增殖能力。這種差異的存在可能源于各自研究手段和研究水平的不同，同時提示我們：出生后第4天有絲分裂指數(shù)峰值的出現(xiàn)與大部分心肌細胞的雙核化和多核化有關(guān)，但也不能排除有小部分完成了之后的胞質(zhì)分裂，真正實現(xiàn)了心肌細胞的分裂增殖。出生后第10天大鼠心室肌細胞有絲分裂趨于停滯，第14天檢測不到，說明出生第10天后，大鼠心肌細胞逐漸喪失了分裂增殖能力。

心肌細胞的有絲分裂過程可分為G0、G1、S、G2和M期。G0/G1和G2/M是有絲分裂能否順利進行的兩個重要檢查點。有實驗[8-10]證明Ccnd1、Ccna2、Ccnb1基因產(chǎn)物CyclinD1、CyclinA2、CyclinB1和Cdk1、Cdk2、Cdk4等是細胞有絲分裂G0/G1、G2/M檢查點時相轉(zhuǎn)換最為重要的促進因子，而Cdkn1a、Cdkn1b基因產(chǎn)物p21、p27則是該時相轉(zhuǎn)換的重要阻滯因子[4]。

圖3 大鼠出生后第1、4、7、10、14天時心肌細胞周期相關(guān)基因的mRNA表達水平

Cyclind1/Cdk4復(fù)合物通過磷酸化Rb蛋白，解除其對E2F的結(jié)合抑制，活化的E2F可激活下游與S期相關(guān)的DNA聚合酶II、胸苷激酶的表達[8]。CyclinA2/Cdk2可促進復(fù)制前復(fù)合物的形成，啟動DNA的合成，是S期進行的關(guān)鍵。CyclinB1/Cdk1活性的逐漸增強被證實是協(xié)調(diào)有絲分裂進程的關(guān)鍵[10]。實驗發(fā)現(xiàn)上述Cyclins/Cdks的mRNA表達水平呈現(xiàn)先上升后下降趨勢（見圖3），出生后第4天的大鼠心肌細胞Ccnd1、Ccna2、Ccnb1、Cdk1、Cdk2和Cdk4出現(xiàn)表達高峰，在出生后第10天表達迅速下降，第14天表達更低，這種表達趨勢的變化與心肌細胞有絲分裂指數(shù)變化趨勢基本一致。Li等[11]認(rèn)為出生后第4天時細胞周期進程相關(guān)基因出現(xiàn)表達高峰與心肌細胞的多核化及肥大性生長有關(guān)。Tamamori等[12]研究認(rèn)為Ccnd1及Cdk4的高水平表達與心肌細胞的增生性生長有關(guān)，而我們的實驗也顯示在大鼠出生后第4～7天的心肌細胞中Ccnd1及Cdk4的表達水平都比較高。

心肌細胞分裂增殖能力的喪失與Cdkn1a、Cdkn1b的表達升高相關(guān)[9]。Stefano等[13]發(fā)現(xiàn)敲除Cdkn1a、Cdkn1b基因可促進胞漿分裂的完成，實現(xiàn)心肌細胞的分裂增殖。Poolman等[4]認(rèn)為Cdkn1a、Cdkn1b基因的表達是心肌細胞退去細胞周期，維持G0/G1和G2/M阻滯的關(guān)鍵所在。我們的實驗發(fā)現(xiàn)，Cdkn1a、Cdkn1b的mRNA表達水平隨大鼠日齡的增加呈現(xiàn)上升趨勢，且在第14天時，表達尤為明顯。Cdkn1a、Cdkn1b表達水平的升高增強了對Cyclin/CDKs活性的抑制，從而導(dǎo)致心肌細胞退出細胞周期，阻礙心肌細胞增殖，這與Stefano[13]和Poolman等[4]的研究結(jié)果相吻合。

心肌細胞的增殖是個多基因、多水平、極其復(fù)雜的調(diào)控過程，細胞周期的退出和增殖能力的喪失必然伴隨著相關(guān)基因和蛋白表達的上調(diào)或下降。通過各種手段檢測并篩選這一過程中的決定性指標(biāo)將有助于闡明心肌細胞退出細胞周期的調(diào)控機制，從而找到促進心肌細胞增殖的靶點，是我們今后研究的方向。

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