響應(yīng)曲面法用于微波提取檸檬皮渣總黃酮研究

廖立敏，劉 月，李建鳳，2，王 碧

（1.內(nèi)江師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，四川 內(nèi)江 641112；2.四川省高等學(xué)?！肮悘U棄物資源化”重點實驗室，四川 內(nèi)江 641112）

響應(yīng)曲面法用于微波提取檸檬皮渣總黃酮研究

廖立敏1，2＊，劉 月1，李建鳳1，2，王 碧1，2＊

（1.內(nèi)江師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，四川 內(nèi)江 641112；2.四川省高等學(xué)校“果類廢棄物資源化”重點實驗室，四川 內(nèi)江 641112）

以60℃下烘干的檸檬皮渣為原料，通過響應(yīng)曲面法設(shè)計微波提取檸檬皮渣總黃酮試驗方案，考察了乙醇濃度、液料比和微波處理時間對提取率的影響，最終得出微波提取檸檬皮渣總黃酮的最佳工藝條件，即乙醇濃度為60%、液料比為30、微波處理時間為4min.在此條件下進行3次平行試驗，結(jié)果表明檸檬皮渣總黃酮的提取率高，而且試驗的重現(xiàn)性好，此時平均提取率為1.20%.

檸檬皮；總黃酮；響應(yīng)曲面；微波提取

檸檬、橙皮渣含有豐富的黃酮類化合物，黃酮類化合物具有抗炎、抗動脈硬化、抗癌、抗氧化等多重生理功效［1-3］.將檸檬、橙皮渣中的黃酮類化合物進行提取并加以利用，不僅可以實現(xiàn)其應(yīng)有的經(jīng)濟價值，而且還能在一定程度上緩解其對當(dāng)?shù)丨h(huán)境的壓力.目前研究者們在提取天然產(chǎn)物中黃酮類化合物方面已經(jīng)做了許多有意義的工作，涉及到的提取方法主要有有機溶劑回流提取法、酶法輔助提取法、超聲波萃取法、CO2超 臨界流 體萃取 法等［4-7］.微波輻射過程是高頻電磁波穿透萃取介質(zhì)，到達物料的內(nèi)部維管束和腺胞系統(tǒng).由于吸收微波能，細胞內(nèi)部溫度迅速上升，使其細胞內(nèi)部壓力超過細胞壁膨脹承受能力，細胞破裂加速有效成分的浸出.響應(yīng)面法是一種綜合試驗設(shè)計和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法，可以在小區(qū)域內(nèi)采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，計算方便［8］.本文以乙醇為溶劑，采用微波提取檸檬皮渣中的黃酮類物質(zhì).在前期研究的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法對工藝條件進行優(yōu)化，為進一步開發(fā)利用提供有價值的工藝參數(shù).

1 實驗部分

1.1 實驗材料

儀器：UWave－1000型微波·紫外·超聲波三位一體合成萃取反應(yīng)儀（上海新儀微波化學(xué)科技有限公司）；T6型新世紀(jì)紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；BT224S電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）.

試劑與原料：蘆?。▏幖瘓F化學(xué)試劑有限公司，含量大于95%）；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、三氯化鋁、三氯化鐵、乙醇、鎂粉及濃硫酸均為分析純（AR）；檸檬（購自四川安岳）.

1.2 實驗方法

1.2.1 黃酮類化合物鑒定 鹽酸－鎂粉反應(yīng)：在少許樣品液中加入少量鎂粉，再滴加1～2滴濃鹽酸，在沸水溶液中加熱2～3min，觀察結(jié)果［9］.鋁鹽反應(yīng)：在少許樣品液中滴加1%AlCl3溶液2～3滴，觀察結(jié)果［10］.濃硫酸反應(yīng)：在少許樣品液中加入少量濃硫酸觀察結(jié)果［11］.

1.2.2 黃酮類化合物提取與測定 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取蘆丁對照品12.50mg于50mL容量瓶中，加入75%乙醇溶解，定容搖勻得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，濃度為0.250 0mg／mL.

測定波長選擇：精密量取蘆丁對照液1.00mL于比色管中，加5%NaNO2溶液0.4mL，搖勻，放置5min，加10%Al（NO3）3溶液0.4mL，搖勻，放置5min，加4%NaOH溶液4mL，再用蒸餾水稀釋至10mL，搖勻，放置15min，在波長300～600nm之間掃描，確定測定波長為510nm.

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確量取蘆丁對照品溶液0、0.50、1.00、1.50、2.00mL 分別于10mL 比色管，75%乙醇定容，在510nm處測吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：A＝11.8110C－0.0108，R2＝0.9995.

總黃酮的提取與測定：檸檬皮洗凈后60℃下干燥，粉碎，過60目篩，稱取3.000g于一圓底燒瓶中，按設(shè)定的液固比加入一定濃度的乙醇，微波功率為400W下處理一段時間后過濾，定容至100mL，吸取1mL顯色后蒸餾水定容至10mL，測定吸光度值.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，得到提取液濃度，總黃酮提取率按下式計算：Et%＝（C×V×n）／W，式中Et%為提取率；C為測得的提取液濃度；V為提取液體積；n為稀釋倍數(shù)；W 為原料的質(zhì)量.

2 結(jié)果與討論

2.1 黃酮類化合物的鑒定

黃酮類化合物鑒定試驗結(jié)果見表1，各現(xiàn)象說明提取液中有黃酮類化合物的存在.

表1 黃酮類化合物鑒定結(jié)果Tab.1 Identification results of flavonoid

2.2 黃酮類化合物提取與測定

2.2.1 提取試驗方案設(shè)計及結(jié)果 應(yīng)用Design Expert 7.0.0軟件，采用 Box－Behnken Design設(shè)計試驗方案，以乙醇濃度（A）、液料比（B）、提取時間（C）為自變量，黃酮提取率（Y）為因變量共設(shè)立了17個處理組（共5組全“0”水平處理組）.因子編碼及水平見表2，由Box－Behnken Design設(shè)計方案所得的試驗結(jié)果見表3（全“0”水平處理兩組，共進行14組試驗）.

表2 試驗因素與水平Tab.2 Factors and levels of experiment

表3 Box－Behnken設(shè)計方案及響應(yīng)值Tab.3 Table 2Box－Behnken design and response values

用Design Expert 7.0.0軟件將表3中試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到提取率對乙醇濃度（A）、液料比（B）、提取時間（C）的二次多項式回歸模型.對所建立的響應(yīng)模型進行方差分析，結(jié)果見表4.由表4可知，試驗選用的模型顯著（P＜0.05）；相關(guān)系數(shù)R＝0.918，說明該模型擬合程度良好，試驗誤差較小，可以用此模型來分析以乙醇為溶劑采用微波對檸檬皮渣黃酮的提取.

表4 回歸模型方差分析Tab.4 Analysis of variance for regression model

回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果見表5.由表5可知，模型一次項A顯著（P＜0.05）、B高度顯著（P＜0.01）、C較顯著（P＜0.1）；二次項A2顯著、B2較顯著、C2顯著；交互項AC較顯著，其他不顯著.

表5 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗Tab.5 Significance test for regression coefficient

2.2.2 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各因素所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，圖1、圖2和圖3為乙醇濃度（A）、液料比（B）、微波處理時間（C）在其中一個固定時，另外兩個對檸檬皮渣黃酮提取率的交互影響曲面圖.比較圖1、圖2和圖3的曲面圖可知，液料比（B）對檸檬皮渣黃酮提取率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，而乙醇濃度（A）和微波處理時間（C）次之，表現(xiàn)為曲線相對平滑.微波處理時間（C）的影響最小，可能是黃酮類化合物在400W微波處理下浸出速度都很大，故提取時間的變化對黃酮提取率影響不顯著.比較圖1、圖2和圖3的等高線圖可以看乙醇濃度（A）和微波處理時間（C）的交互影響相對較為顯著，表現(xiàn)為等高線最密集，結(jié)果與方差分析相似.

圖1 乙醇濃度、液料比及其交互作用對提取率的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration，liquid－solid ratio and their interactions on the extraction yield

2.2.3 優(yōu)化與驗證 根據(jù)回歸模型，得出檸檬黃酮最佳提取條件為：乙醇濃度為63.33%，液料比為30，微波處理時間為4min，黃酮得率的理論預(yù)測值為1.24%.考慮到實際操作的便利，確定檸檬皮中黃酮類化合物的優(yōu)化提取工藝條件為：乙醇濃度為60%，液料比為30，微波處理時間為4min，重復(fù)試驗3次，得黃酮提取率分別為1.23%、1.19%、1.17%，平均值為1.20%，與預(yù)測值為1.24%基本一致，即該方程與實際情況擬合很好，響應(yīng)曲面法適用于對檸檬黃酮的微波提取工藝分析和參數(shù)優(yōu)化.

圖2 乙醇濃度、提取時間及其交互作用對提取率的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration，extraction time and their interactions on the extraction yield

圖3 液料比、提取時間及其交互作用對提取率的影響Fig.3 Effects of liquid－solid ratio，extraction time and their interactions on the extraction yield

3 結(jié)論

本文采用響應(yīng)面法設(shè)計試驗方案，得出檸檬皮渣總黃酮微波法乙醇提取的最佳工藝條件，在此條件下對檸檬皮渣總黃酮進行提取，不但提取率更高，而且試驗的重現(xiàn)性好.本文對于天然產(chǎn)物中有效成分的提取研究具有一定的參考價值.

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Study on microwave extraction of total flavonoids of lemon peel using response surface methodology

LIAO Limin1，2，LIU Yue1，LI Jianfeng1，2，WANG Bi1，2
（1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Neijiang Normal University，Neijiang，Sichuan 641112；2.Key Laboratory of Fruit Waste Treatment and Resource Recycling，Neijiang，Sichuan 641112）

Lemon peel，which was dried at 60℃，was used as the raw materials in this study.Experiments of extraction with microwave for total flavonoids of lemon peel were planned by response surface methodology.The effects of alcohol concentration，ratio of solution to solid and microwave processing time on the extraction rate were studied.The best conditions of extraction with microwave were obtained.When the ethanol concentration was 60%，the ratio of solution to solid was 30and the extraction time was 4min，the extraction rate reached the maximum.Under this condition，3paralleled experiments were carried out.The results showed that the extraction rates of total flavonoids of lemon peel were high and the experiments with good reproducibility；the average extraction rate was 1.20%.This paper may have a certain reference value for the extraction of active ingredient of natural products.

lemon peel；total flavonoids；response surface；microwave extraction

R284；Q946

A

1000－1190（2012）05－0569－04

2012－04－11.

2012年內(nèi)江師范學(xué)院重點項目（12NJZ01）.

＊通訊聯(lián)系人.E－mail：wangbi05＠126.com；liaolimin523＠126.com.