纖維素酶在不同長度纖維上的吸附行為

呂 健 詹懷宇 付時(shí)雨

（華南理工大學(xué)制漿造紙工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州，510640）

在生物質(zhì)能源替換傳統(tǒng)石化能源的過程中，纖維素乙醇扮演著重要的角色［1］。纖維素乙醇是以自然界大量存在的纖維素為原料，通過糖化、發(fā)酵的過程得到的。纖維素的糖化過程始于纖維素酶吸附于纖維素，形成復(fù)雜的纖維素-纖維素酶復(fù)合結(jié)構(gòu)，各種纖維素酶分子進(jìn)而攻擊纖維素，降解生成葡萄糖及可溶性糖。研究證明，纖維素酶的吸附平衡常數(shù)與纖維素水解速率有強(qiáng)烈的對應(yīng)關(guān)系［2］，因此，纖維素酶在纖維素上的吸附在一定程度上決定了纖維素酶水解的效率。用于定量描述纖維素酶吸附的模型主要有Langmuir吸附等溫式［3-5］和Freundlich吸附等溫式［6］。雖然纖維素酶在纖維素上的吸附并不完全滿足Langmuir吸附和Freundlich吸附的假設(shè)，但實(shí)際應(yīng)用中兩者對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都表現(xiàn)出很好的擬合性，可以在工程中近似應(yīng)用。

從已有的研究來看，纖維的結(jié)晶結(jié)構(gòu)和形態(tài)不同，纖維素酶的吸附行為也不同［5，7-8］。用于纖維素乙醇工業(yè)的纖維來源以及處理方式不同，其尺寸差別很大，其中表現(xiàn)最直觀的就是纖維長度不同。定量研究纖維素酶在不同長度纖維上的吸附，對后續(xù)的酶水解過程有重要的指導(dǎo)意義。用于纖維素酶水解糖化的底物主要為經(jīng)過預(yù)處理的木質(zhì)纖維原料，不可避免保留大量木素，造成纖維素酶的無效吸附。本研究旨在探討纖維素酶在纖維上的吸附，不考慮其在木素上的無效吸附，故選擇漂白木漿纖維為底物，以進(jìn)一步探知纖維素酶在不同長度纖維上的等溫吸附，以及吸附的熱力學(xué)性質(zhì)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品、原料及儀器

漂白針葉木漿：購自Buckeye Cellulose工廠；纖維素酶：Cellic CTec，購自Novozyme公司，酶活力66FPU/mL，蛋白質(zhì)含量137mg/L；蛋白質(zhì)檢測包：BCA蛋白質(zhì)檢測試劑包，購自ThermoFisher Scientific公司；檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，pH值4.8。

離散式全自動化學(xué)分析儀（DA3500）：美國O.I.Analytical公司生產(chǎn)；結(jié)合BCA蛋白質(zhì)檢測試劑包，用于溶液中蛋白質(zhì)的定量測定。

1.2 不同長度纖維的篩分

將漂白針葉木漿浸泡于蒸餾水中，約2h待充分潤脹后用纖維疏解器疏解纖維。為了避免纖維性質(zhì)發(fā)生改變，在低濃（約0.5％，質(zhì)量分?jǐn)?shù)）和低轉(zhuǎn)數(shù)（約500轉(zhuǎn)）條件下進(jìn)行疏解。使用圓柱形水力旋流器篩分疏解分散好的纖維，分別收集28目、48目和100目不同長度的纖維，風(fēng)干后待用。

1.3 纖維素酶的吸附動力學(xué)實(shí)驗(yàn)

首先用緩沖溶液將纖維素酶稀釋至不同體積分?jǐn)?shù)（0.05％、0.1％和0.2％），然后將0.2g（絕干）纖維分散在10mL上述不同體積分?jǐn)?shù)的酶溶液中，配成0.2％（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的纖維懸浮液。將配好的纖維懸浮液置于振蕩水域中進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)，保持溫度20℃、轉(zhuǎn)速120r/min。每隔一定時(shí)間，取出樣品，用0.2μm的玻璃纖維過濾器過濾，取濾液進(jìn)行蛋白質(zhì)分析。溶液中初始蛋白質(zhì)含量與濾液中蛋白質(zhì)含量之差即為吸附的蛋白質(zhì)含量。

1.4 纖維素酶的等溫吸附

將0.2g（絕干）纖維分散在10mL不同體積分?jǐn)?shù)（0.02％～0.2％）的纖維素酶溶液中。將配好的纖維懸浮液置于振蕩水域中進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)，恒定溫度、轉(zhuǎn)速120r/min。待吸附平衡后，取出樣品，用0.2μm的玻璃纖維過濾器過濾，取濾液進(jìn)行蛋白質(zhì)分析。溶液中初始蛋白質(zhì)含量與濾液中蛋白質(zhì)含量之差即為吸附的蛋白質(zhì)含量。被吸附的纖維素酶含量通過纖維素酶與蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)換關(guān)系得到。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素酶在纖維素上的吸附動力學(xué)

纖維素酶在纖維上的吸附是一個(gè)動態(tài)過程，隨吸附時(shí)間的延長，其吸附量不斷變化。但是，纖維素酶的吸附同樣存在平衡狀態(tài)，即吸附達(dá)到一定程度后，吸附量達(dá)到飽和。研究表明，纖維素酶在纖維上的吸附平衡時(shí)間約為30～60min［9-10］。在不同實(shí)驗(yàn)條件下，纖維來源不同，其吸附性質(zhì)也存在差異。在本實(shí)驗(yàn)條件下，研究了不同體積分?jǐn)?shù)的Cellic CTec在漂白針葉木漿上的吸附動力學(xué)，以確定吸附平衡時(shí)間。纖維素酶溶液初始的體積分?jǐn)?shù)分別為0.05％、0.1％和0.2％，其吸附的蛋白質(zhì)含量隨時(shí)間的變化如圖1所示。

圖1 不同體積分?jǐn)?shù)的纖維素酶在漂白針葉木漿上的吸附動力學(xué)

從圖1可以看出，纖維素酶在漂白針葉木漿上的吸附均表現(xiàn)為先快速吸附，然后緩慢吸附直至達(dá)到吸附平衡；同時(shí)，可在低體積分?jǐn)?shù)的纖維素酶（對纖維來說，纖維素酶用量低）溶液中快速達(dá)到吸附平衡；在本實(shí)驗(yàn)最高體積分?jǐn)?shù)（0.2％）的纖維素酶溶液中，吸附平衡發(fā)生在60min左右。由于下述等溫吸附實(shí)驗(yàn)初始纖維素酶體積分?jǐn)?shù)均不超過0.2％，因此，認(rèn)為所有吸附實(shí)驗(yàn)均在60min達(dá)到吸附平衡。

2.2 纖維素酶在不同長度纖維上的等溫吸附

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同長度纖維的酶水解行為差別很大，這主要是由纖維素酶與纖維相互作用引起的。不同長度纖維的物理結(jié)構(gòu)如孔隙率、比表面積都不相同，這決定了其與纖維素酶的吸附存在差異。為了研究纖維素酶與不同長度纖維的吸附行為，使用不同體積分?jǐn)?shù)（0～0.2％）的Cellic CTec在2％（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）纖維懸浮液中進(jìn)行吸附平衡實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果如圖2所示。3種長度的纖維分別標(biāo)示為28目、48目和100目，分別表示截留在28目篩網(wǎng)上、截留在28目篩網(wǎng)和48目篩網(wǎng)之間、截留在48目篩網(wǎng)和100目篩網(wǎng)之間的纖維，其物理性質(zhì)如表1所示。由表1可知，3種纖維的差別主要在于纖維長度和扭結(jié)角。

圖2 20℃時(shí)纖維素酶在不同長度纖維上的吸附等溫線

表1 3種纖維的物理性質(zhì)

分別利用Langmuir吸附等溫式和Freundlich吸附等溫式對圖2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，以確定何種吸附等溫式更能準(zhǔn)確描述纖維素酶在纖維上的吸附。

2.2.1 Langmuir吸附等溫式

式（1）中，Ed表示被吸附的纖維素酶含量，Emax表示纖維素酶的最大吸附量，Ef表示吸附平衡時(shí)溶液中的纖維素酶含量，Kd表示Langmuir吸附平衡常數(shù)。

將式（1）寫成線性形式，可得

2.2.2 Freundlich吸附等溫式

同樣，將式（3）寫成線性形式，可得

分別計(jì)算得到20℃時(shí)纖維素酶在不同長度纖維上的Langmuir等溫吸附常數(shù)和Freundlich等溫吸附常數(shù)（見表2）。

表2 20℃時(shí)纖維素酶在不同長度纖維上的等溫吸附常數(shù)

從表2可知，Langmuir吸附等溫式對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合得更好，更能從本質(zhì)上表現(xiàn)出纖維素酶的吸附性質(zhì)。隨纖維長度減?。◤?8目到100目），纖維素酶在纖維上的最大吸附量增加（從34.06mg/g增加到47.13mg/g），Langmuir吸附平衡常數(shù)下降（從5.14L/g下降到2.88L/g）。由于短纖維相對于長纖維具有更大的比表面積，而吸附量與吸附介質(zhì)的比表面積是成正比的，因此，纖維素酶在100目纖維上具有最大的吸附量。纖維素酶在28目長纖維上有最大的吸附平衡常數(shù)，說明纖維素酶更容易在長纖維上達(dá)到吸附平衡。

2.3 纖維素酶吸附的熱力學(xué)性質(zhì)

為了進(jìn)一步探討纖維素酶在纖維上的吸附機(jī)理，需要研究纖維素酶的吸附熱力學(xué)性質(zhì)。通過改變溫度（5、20、35、50℃），研究了纖維素酶Cellic Ctec在不同長度纖維上的Langmuir等溫吸附線（見圖3）。

根據(jù)Van’t Hoff方程，有

圖3 纖維素酶在不同溫度和不同長度纖維上的等溫吸附

式（5-A）和式（5-B）中，Kd’、ΔH°、ΔS°、R和T分別代表Langmuir吸附平衡常數(shù)（L/mol）、吸附焓變（J/mol）、吸附熵變（J/（K·mol））、氣體常數(shù)（8.314J/（mol·K））和溫度（K）。值得注意的是，式中的K’d與2.2節(jié)中的Langmuir吸附平衡常數(shù)Kd關(guān)系為

式（6）中，MA為纖維素酶的摩爾質(zhì)量，根據(jù)文獻(xiàn)［11］，其取值范圍為41000～67000g/mol。為方便計(jì)算，本研究取值為60000g/mol。

根據(jù)吉布斯自由能的定義

可以得到吉布斯自由能與平衡常數(shù)的關(guān)系

根據(jù)式（5）～式（8），可以計(jì)算出纖維素酶在不同長度纖維上吸附的熱力學(xué)常數(shù)（見表3）。

表3 纖維素酶在不同長度纖維上吸附的熱力學(xué)常數(shù)

從表3可以看到，隨溫度的升高，Langmuir吸附平衡常數(shù)減小，說明纖維素酶在低溫下可更快地與纖維素達(dá)到吸附平衡。ΔG°=ΔH°-TΔS°＜0，表明纖維素酶在不同長度纖維上的吸附都是自發(fā)過程。隨溫度的升高，ΔG°的絕對值增加，說明吸附過程的自發(fā)程度增加，這對3種長度纖維都是適用的。在相同溫度下，ΔG°絕對值隨纖維長度的減小而減小。一般來說，當(dāng)ΔG°的范圍在0～-20kJ/mol時(shí)，吸附為物理吸附；當(dāng)ΔG°的范圍在-80～-400kJ/mol時(shí)，吸附為化學(xué)吸附［12］。表3中ΔG°均處于-28.62～-32.27kJ/mol之間，說明纖維素酶在3種長度纖維上的吸附同時(shí)存在物理吸附和化學(xué)吸附。從表3還能看出ΔH°為負(fù)值，表明吸附是放熱過程。纖維素酶在3種長度纖維上的吸附焓變相近，在48目纖維上吸附的放熱程度稍大。反應(yīng)熵變ΔS°＞0，說明纖維素和酶分子的吸附界面上的無序程度增加，在28目纖維上吸附的無序程度增加最大。另外，所有吸附過程的ΔH°＜0、ΔS°＞0，說明正反應(yīng)過程即吸附過程是自發(fā)進(jìn)行的，但是如果在只改變溫度條件下，逆反應(yīng)過程即解吸過程的ΔG°＞0，即解吸不可能自發(fā)進(jìn)行，這證明諸多文獻(xiàn)中提到的纖維素酶的吸附是不可逆的結(jié)論［13-15］。

3結(jié)語

本研究探討了纖維素酶在不同長度纖維上的吸附過程，吸附動力學(xué)表明酶吸附量隨初始酶用量的增加而增大，吸附達(dá)到平衡的時(shí)間約為60min。纖維素酶在不同長度纖維上的等溫吸附平衡滿足Langmuir吸附等溫式，最大吸附量隨纖維長度增加而減??；而Langmuir吸附平衡常數(shù)隨纖維長度增加而增加，表明纖維素酶在長纖維上可更快達(dá)到吸附平衡。在5～50℃范圍內(nèi)，纖維素酶Langmuir吸附平衡常數(shù)隨溫度升高而減小。吸附的熱力學(xué)常數(shù)表明纖維素酶在纖維上的吸附介于物理吸附和化學(xué)吸附之間，是自發(fā)、放熱，且不可逆的過程。吸附吉布斯自由能變化ΔG°隨纖維長度減小而減小，但吸附焓變ΔH°和吸附熵變ΔS°與纖維長度關(guān)系不大。對3種長度的纖維，纖維素酶在48目纖維上有最大的吸附焓變ΔH°，在28目纖維上有最大的吸附熵變ΔS°。如果能把纖維素酶的吸附平衡常數(shù)及吸附熱力學(xué)常數(shù)與后續(xù)的纖維素酶解糖化動力學(xué)結(jié)合，將為深入探索纖維素酶降解的本質(zhì)提供途徑。

［1］Brethauer S，Wyman C E.Review：Continuous hydrolysis and fermentation for cellulosic ethanol production［J］.Bioresource Technology：2010，101（13）：4862.

［2］Klyosov A A.Trends in biochemistry and enzymology of cellulose degradation［J］.Biochemistry：1990，29（47）：10577.

［3］Kadam K L，Rydhom E C，McMillan J D.Development and validation of a kinetic model for enzymatic saccharification of lignocellulosic biomass［J］.Biotechnology Progress：2004z，20（3）：678.

［4］Lu Y P，Yang B，Gregg D，et al.Cellulase adsorption and an evaluation of enzyme recycle during hydrolysis of steam-exploded softwood residues［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology：2002，98：641.

［5］Ooshima H，Sakata M，Harano Y.Adsorption of cellulase from Trichoderma-viride on cellulose［J］.Biotechnology and Bioengineering：1983，25（12）：3103.

［6］Medve J，Stahlberg J，Tjerneld F.Isotherms for adsorption of cellobiohydrolase I and II fromTrichoderma reeseion microcrystalline cellulose［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology：1997，66（1）：39.

［7］Mooney C A，Mansfield S D，Beaston R P，et al.The effect of fiber characteristics on hydrolysis and cellulase accessibility to softwood substrates［J］.Enzyme and Microbial Technology：1999，25（8/9）：644.

［8］Ramos L P，Nazhad M M，Saddler JN.Effect of enzymatic hydrolysis on the morphology and fine structure of pretreated cellulosic residuals［J］.Enzyme and Microbial Technology：1993，15（10）：821.

［9］Lynd L R，Weimer P J，van Zyl WH，et al.Microbial cellulose utilization：fundamentals and biotechnology［J］.Microbiology and Molecular Biology Reviews：2002，66（3）：506.

［10］Tu M B，Chanadra R P，Saddler J N.Recycling cellulases during the hydrolysis of steam exploded and ethanol pretreated lodgepole pine［J］.Biotechnology Progress：2007，23（5）：1130.

［11］Ericsen J，Goksoyr J.Cellulases fromChaetomium-Thermophilevar.dissitum［J］.European Journal of Biochemistry：1977，77（3）：445.

［12］Jaycock M J，Parfitt G D.Chemistry of Interface［M］.New York：Halsted Press，1981.

［13］Kyriacou A，Neufeld R J，MacKenzie C R.Reversibility and competition in the adsorption ofTrichoderma reeseicellulase components［J］.Biotechnology and Bioengineering：1989，33（5）：631.

［14］Carrard G，Linder M.Widely different off rates of two closely related cellulose-binding domains fromTrichoderma reesei［J］.European Journal of Biochemistry：1999，262（3）：637.

［15］Beltrame P L，Carniti P，F(xiàn)ocher B，et al.Cotton cellulose：enzyme adsorption and enzymatic hydrolysis［J］.Journal of Applied Polymer Science：1982，27（9）：3493.