蔡少華 劉仲華 黃建安 王坤波
(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點實驗室,湖南 長沙 410128;2.國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心,湖南 長沙 410128)
酯型茶黃素酶促降解條件的優(yōu)化
蔡少華 劉仲華 黃建安 王坤波
(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點實驗室,湖南 長沙 410128;2.國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心,湖南 長沙 410128)
比較單寧酶、脂肪酶、豬胰脂肪酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、糖化酶、果膠酶和α-淀粉酶對酯型茶黃素(TFDG)的水解效果,并對最佳水解酶的反應(yīng)條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明,單寧酶水解酯型茶黃素的效果最好,其反應(yīng)最佳條件為反應(yīng)體系的溫度40℃、pH 值5.0、酶濃度2.4mg/mL、最佳反應(yīng)時間120min。水解后茶黃素中簡單茶黃素(TF)的含量從52.51mg/g提高到199.84mg/g。
茶黃素;水解酶;單寧酶
茶黃素(theaflavins,TFs)是紅茶加工過程中兒茶素類酶促氧化縮合形成的一類色素,與紅茶品質(zhì)高度相關(guān),紅茶中茶黃素的質(zhì)量分數(shù)達0.5%~3%。TFs是一類能溶于乙酸乙酯、具有苯并卓酚酮結(jié)構(gòu)的化合物的總稱[1]。目前已發(fā)現(xiàn)并鑒定的茶黃素有25種,其中最主要的4種分別為TF、TF-3-G、TF-3’-G和 TFDG。其中 TF由于化學(xué)結(jié)構(gòu)中不含沒食子?;?,被稱為簡單茶黃素,后3種茶黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有一個或兩個沒食子酰基,被稱為酯型茶黃素,4種茶黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。
圖1 4種主要茶黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1 The chemical structure of four main theaflavins
現(xiàn)已證實,茶黃素具有較好的抗氧化、降脂、降膽固醇和抗腫瘤作用[2-6]。不同的茶黃素組分其功能活性不同[6-8],但酯型茶黃素由于結(jié)構(gòu)特點,其在水中的溶解度比簡單茶黃素相對較低。紅茶飲料,尤其是在以茶黃素為主要原料的功能飲料中,如果酯型茶黃素的比例過高,難溶于水的酯型茶黃素會通過分子間相互作用力聚集形成大量沉淀,不但影響產(chǎn)品外觀,而且降低了茶黃素被人體攝入的可能性,進而影響茶黃素功效的有效發(fā)揮。為了獲得溶解性好的簡單茶黃素,本試驗將單寧酶、脂肪酶、豬胰脂肪酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、糖化酶、果膠酶和α-淀粉酶對酯型茶黃素的水解效果進行比較,篩選最佳水解酶,并確定該酶水解酯型茶黃素的最佳反應(yīng)條件,最終使簡單茶黃素的含量得到顯著提高,旨在探討茶黃素酶促水解的可能途徑,以期為TF單體的制備、功能飲料、天然化妝品、口服液等茶黃素類保健產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。
紅茶提取物粉末(TF∶TF-3-G∶T-3’-G∶TFDG=1∶2.37∶0.90∶3.49):TFs質(zhì)量分數(shù)為31%,長沙飛拓植物制品有限公司;
黑曲霉單寧酶:200U/g,昆明杰輝物技術(shù)有限公司;
脂肪酶1:5 000U/g,日本 Meito公司;
脂肪酶2:5×105U/g,深圳綠微康生物工程有限公司;
豬胰脂肪酶:2.5×104U/g,上海伯奧生物科技有限公司;
木瓜蛋白酶:8×105U/g,上海生物化學(xué)試劑公司;
胰蛋白酶:2.5×105U/g,中國醫(yī)藥(集團)上海化學(xué)試劑公司;
果膠酶:5 000U/g,德國Serva公司;
α-淀粉酶:2 000U/g,德國 Merck公司;
糖化酶:500U/g,無錫酶制劑廠;
乙腈、甲醇:色譜純,國藥集團化學(xué)試劑廠;
乙酸乙酯、冰醋酸、無水乙醇、Na2HPO4、NaH2PO4:分析純,國藥集團化學(xué)試劑廠。
高效液相色譜儀:LC-10ATVP,日本島津公司;
色譜數(shù)據(jù)工作站:LC solution,日本島津公司;
色譜柱:Ecosil C185μm×4.6mm×150mm,日本Lubex公司;
電子天平(0.0001):4504MP,美國 Mettler-Toledo公司;
超聲波清洗器:KQ3200B型,昆明市超聲儀器有限公司;
pH 計:DELTA-320,美國 Mettler-Toledo公司;
搖床:SKY-200B,上海蘇坤實業(yè)有限公司。
1.3.1 茶黃素溶液的配制 準確稱取TFs質(zhì)量分數(shù)為31%的紅茶提取物粉末1.000 0g,溶于100mL乙醇中,超純水定容至1 000mL,配制成0.1%質(zhì)量濃度的溶液待用,此時TF濃度為52.51mg/g。
1.3.2 茶黃素液相色譜分析方法 色譜柱為Ecosil C185μm×4.6mm×150mm,流動相 A為2%醋酸,流動相B為乙腈-乙酸乙酯(體積比7∶1),梯度洗脫,流動相B在30min內(nèi)從18%線性梯度變化到30%,流速0.9mL/min;柱溫40℃;檢測波長280nm;進樣量10μL。
1.3.3 酶解試驗方法 以未加酶的0.1g/L茶黃素溶液作為對照,分別取適量α-淀粉酶、單寧酶、脂肪酶1、脂肪酶2、豬胰脂肪酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、糖化酶和果膠酶,加超純水定容至10mL,得到酶活力均為1 000U的酶溶液。將酶溶液轉(zhuǎn)移至具塞錐形瓶中,分別加入40mL 0.1g/L茶黃素溶液,用磷酸緩沖鹽將含單寧酶、果膠酶的溶液pH值調(diào)為4.5,其余溶液pH值調(diào)為7.0,使其pH值均處于酶活力pH值范圍內(nèi),置于搖床中,于37℃、120r/min反應(yīng)24h,進行高效液相色譜分析。
1.3.4 單因素試驗設(shè)計方案
(1)單寧酶添加量對單寧酶水解酯型茶黃素的影響:以0.1g/L茶黃素溶液為原料,調(diào)單寧酶濃度為0.2,0.6,1.0,1.4,1.6,2.0,2.4,3.0,4.0,6.0mg/mL,于37 ℃、120r/min搖床中反應(yīng)12h,高效液相色譜檢測茶黃素各組分的含量。
(2)反應(yīng)溫度對單寧酶水解酯型茶黃素的影響:以0.1g/L茶黃素溶液為原料,取酶濃度2.4mg/mL,在溫度分別為 20,25,30,35,40,45,50,55,60 ℃,和120r/min、pH 7.0條件下反應(yīng)12h,高效液相色譜檢測茶黃素各組分的含量。
(3)反應(yīng)時間對單寧酶水解酯型茶黃素的影響:以0.1g/L茶黃素為原料,單寧酶添加量為2.4mg/mL,溫度為40℃,120r/min,pH 7.0的條件下反應(yīng),每隔30min取樣1次作高效液相色譜分析。
(4)pH值對單寧酶水解酯型茶黃素的影響:以0.1g/L茶黃素溶液為原料,單寧酶添加量2.4mg/mL,溫度為40℃,120r/min,pH 分 別為3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0的條件下反應(yīng)2h,利用高效液相色譜檢測茶黃素各組分的含量。
酶解后4種茶黃素的含量見表1。
表1 水解酶對酯型茶黃素的水解效果Table 1 Effect of different hydrolyticenzymes on estertheaflavins /(mg·g-1)
由表1可知,單寧酶能有效水解酯型茶黃素,其中TFDG的含量明顯降低,TF的含量明顯提高,其余酶的加入基本不影響4種茶黃素比例的變化,說明它們對酯型茶黃素的降解效果不明顯,故以優(yōu)選出的單寧酶進行下一步試驗。從茶黃素的分子結(jié)構(gòu)看,酯型茶黃素的沒食子酰基暴露于吡喃環(huán)外側(cè),較為活潑,易于被水解酶切除。α-淀粉酶、脂肪酶、豬胰脂肪酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、糖化酶和果膠酶均屬于水解酶類,且它們均能在酯的合成中起到催化作用,而酯的水解是酯的合成的逆反應(yīng),故上述各酶在一定的條件下可能會起到水解酯的作用[9-10]。單寧酶對沒食子酸酯具有專一水解性,已廣泛應(yīng)用于酯型兒茶素的水解[11]。
根據(jù)單因素試驗的結(jié)果,對上述因素作四因素三水平的正交分析,因素水平設(shè)置見表2,L9(34)正交試驗結(jié)果見表3。
表2 正交因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment
表3 L9(34)試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 The table of orthogonal experiment of the L9(34)
由表3的極差分析可以看出,各因素對TF含量影響的順序是A>C>D>B;酶解條件的最佳組合是A2B2C1D2,即pH值5、溫度40℃、反應(yīng)時間2h、酶濃度2.4mg/mL,該組合條件下所得產(chǎn)物TF質(zhì)量濃度為199.84mg/g,優(yōu)于單因素試驗的結(jié)果和正交組合中試驗號6的198.37mg/g的最高TF質(zhì)量濃度。方差分析的結(jié)果見表4。由表4可知,pH和反應(yīng)時間對單寧酶水解茶黃素的影響顯著。
表4 正交試驗方差分析表Table 4 The table of variance analysis of orthogonal experiment
在40℃、pH=5、酶濃度2.4mg/mL條件下,將0.1g/L的茶黃素溶液置于搖床中以120r/min反應(yīng)2h,單寧酶處理前后4種茶黃素含量的對比見表5。由表5可知,所得產(chǎn)品中TF的含量達199.84mg/g,較原有產(chǎn)品有很大的提高。3種酯型茶黃素 TF-3-G、TF-3’-G和 TFDG的水解較為徹底,TFDG被單寧酶切除兩個沒食子酰基,TF-3-G 和 TF-3’-G被單寧酶切除一個沒食子酰基,3種酯型茶黃素的水解后的終產(chǎn)物均為TF和沒食子酸。
表5 單寧酶處理前后4種茶黃素含量對比Table 5 The contrast of four theaflavins contents before and after the Tannase treatment /(mg·g-1)
(1)單寧酶對酯型茶黃素的水解效果優(yōu)于其他水解酶,對單寧酶水解酯型茶黃素的反應(yīng)條件優(yōu)化后,3種酯型茶黃素已基本轉(zhuǎn)化為TF,利用單寧酶水解技術(shù)能夠得到TF含量高的茶黃素。相較于常規(guī)色譜分離法,整個處理過程只用到少量乙醇,沒有其他任何有害溶劑的介入,水解反應(yīng)時間只需2h,該項技術(shù)具有綠色、高效的特點,且TF在水中的溶解度比酯型茶黃素要高,拓寬了茶黃素在食品、化妝品,特別是功能性飲料領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。
(2)單寧酶在水解酯型茶黃素的同時,也能水解茶黃素中殘存的酯型兒茶素,水解后的兒茶素更容易通過柱層析與茶黃素分離。在高TF含量的茶黃素基礎(chǔ)上,通過大孔樹脂去除混合物中的兒茶素、沒食子酸、咖啡堿、綠原酸等雜質(zhì),可以純化制備TF單體,為TF單體的開發(fā)提供了一種簡單高效的新思路。
(3)如何利用固定化單寧酶水解酯型茶黃素,從而降低TF的生產(chǎn)成本,以及TF在不同環(huán)境條件下的穩(wěn)定性試驗,是該領(lǐng)域下一步的研究熱點。
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Optimization on hydrolysis condition of estertheaflavins by hydrolytic enzymes
CAI Shao-h(huán)ua LIU Zhong-h(huán)ua HUANG Jian-anWANG Kun-bo
(1.Key Lab of Tea Science of Ministry of Education,Hunan Agricultural University,Changsha,Hunan410128,China;2.National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients,Changsha,Hunan410128,China)
The research was designed by using enzymes including tannase,lipase,porcine pancreatic lipase,papain,trypsin,glucoamylase,pectinase andα-amylase,to compare the hydrolytic effect of estertheaflavins(TFDG)and to obtain the optimum reaction conditions of the best hydrolase was selected.Results showed that the optimum condition were as follows:temperature of reaction system 40℃,pH 5,enzyme concentration 2.4mg/mL,reaction time 120min.The content of TF increased from 52.51mg/g to 199.84mg/g under these optimum conditions.
theaflavins;hydrolase;tannase
10.3969/j.issn.1003-5788.2011.03.036
國家自然科學(xué)基金(編號:30901161);科技部國際合作重點項目(編號:2006DFA33220);國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(編號:2010)
蔡少華(1986-),男,湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。E-mail:ahua_cai@yahoo.com.cn
劉仲華
2011-03-01