退火溫度對聚合酶鏈式反應焓值的影響

周國燕 藍 浩 李紅衛(wèi)

（上海理工大學生物系統(tǒng)熱科學研究所，上海 200093）

退火溫度對聚合酶鏈式反應焓值的影響

周國燕 藍 浩 李紅衛(wèi)

（上海理工大學生物系統(tǒng)熱科學研究所，上海 200093）

在聚合酶鏈式反應（PCR）熱循環(huán)中，退火溫度的選取至關重要，該因素的稍微變化對PCR擴增會產(chǎn)生很大的影響，導致整個PCR的熱現(xiàn)象變化。通過差示掃描量技術（DSC）研究HBV在不同退火溫度時焓值隨循環(huán)數(shù)的變化。結果表明：PCR擴增在變性階段吸熱，在退火和延伸階段放熱，每一個PCR循環(huán)呈現(xiàn)放熱效應，同時退火溫度高導致平臺期的前移和焓值的降低，53℃退火最佳。

聚合酶鏈式反應；焓值；差示掃描熱量技術；退火溫度；循環(huán)數(shù)

聚合酶鏈式反應 （polymerase chain reaction，簡 稱PCR），是一種體外快速擴增特異 NA片段技術［1］，由Kary.B.Mullis等于1985年在PE－Cetus公司發(fā)明并命名。PCR雖然在設計上十分簡單，但實際上是個非常復雜的生化反應過程，目前為止還是一種半經(jīng)驗性的技術，此外PCR的高度敏感性導致任何因素的微小變化都會很大程度影響檢測結果，如假陰、假陽性問題和非特異擴增［2］。故探索研究PCR的影響因素及控制方法很有必要。

PCR熱循環(huán)過程各階段溫度的選取對其擴增結果的影響很大，其中退火溫度的高低不僅決定著反應的特異性，也影響著反應的擴增效率?，F(xiàn)有的研究［3，4］表明：退火過程首先是引物和模板形成復合物，其次形成引物－模板－酶三倍體復合物，該過程伴隨著化學鍵的不斷生成和斷裂，引起吸放熱現(xiàn)象的產(chǎn)生。Conceicao等［5］用等溫滴定法研究了模板引導DNA復制過程中的堿基插入和延伸時熱動力學變化，結果表明酶促催化的堿基插入和DNA延伸過程是個放熱過程。此外，隨著循環(huán)數(shù)的增加，擴增效率的變化以及引物二聚體等物質的生成，引起的熱現(xiàn)象也不同，故可從量熱學角度研究退火溫度對PCR擴增的影響。

差示掃描量熱術（differential scanning calorimetry，簡稱DSC）指“在程序溫度下測量輸入到試樣和參比物的功率差與溫度關系的技術”，是最近幾年發(fā)展起來的量熱技術，對研究DNA精確復制有著十分重要的意義［6－11］。本試驗依據(jù)PCR反應的溫度特性，設置合理的DSC溫度掃描程序，在DSC上實現(xiàn)PCR擴增，研究退火溫度為55，54，53，52℃時PCR擴增各階段的熱流及其隨循環(huán)數(shù)的變化情況，探討了不同退火溫度的熱現(xiàn)象與PCR的假陰性和擴增效率的關系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

模板：重組質粒 pUC－19，每質粒的拷貝數(shù)為1.5×103COPIES/μL，帶有HBV完整基因組，吉林大學第二醫(yī)院中心實驗室提供；

大腸桿菌JM109：吉林大學第二醫(yī)院中心實驗室提供；

Taq DNA聚合酶、dNTP：大連寶生物工程有限公司；

質粒DNA小量抽提試劑盒：杭州愛思進生物技術公司；

差示掃描量熱儀：DSC－Pyris Diamond，美國 Perkin Elmer公司；

天平：BP－211D，賽多利斯公司；

其他試劑：均為國產(chǎn)分析純。

1.2 AXYGEN試劑盒提取質粒

培養(yǎng)、收集含有重組質粒pUC－19的大腸桿菌細胞［12］，回收和純化質粒DNA。用紫外分光光度計測出質粒濃度為96.9μg/mL（A260/A280＝1.80），計算出每質粒的拷貝數(shù)為1.5×1010copies/μL，質粒倍比稀釋得到本試驗采用的質粒濃度1.5×106copies/μL［13］。

1.3 引物設計

根據(jù)GeneID：944568，設計擴增HBV前C基因合適的引物。本試驗所用的引物委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成并純化。合成的HBV前C區(qū)基因引物序列：5′－TTT GGG GCA TGG ACA TTG AC－3′；5′－GCC TCG TCG TCT AAC AAC AG－3′。

1.4 PCR反應體系

PCR反應體系組成如表1所示。

表1 PCR反應體系組成Table 1 Reagent concentration in PCR experiment

1.5 DSC掃描程序

常溫下加樣，變性溫度為94℃，持續(xù)時間為0.8min；退火溫度依次為55，54，53℃，持續(xù)時間為0.8min；延伸溫度為72℃，持續(xù)時間為1.0min，30個循環(huán)，最后一個循環(huán)延伸時間增加3min。升降溫掃描速率都為200℃/min，冷卻采用Perkin－Elmer公司的二級制冷CryoFillTM；樣品沖洗氣體為高純度氮氣（純度＞99.999%），流量20mL/min保持不變；樣品皿為PE不銹鋼高壓皿。

2 結果與分析

將配制好的14μL PCR反應體系于PE高壓皿中，采用上述1.5的DSC溫度掃描程序在DSC－Pyris Diamond上依次進行退火溫度為55，54，53℃的PCR擴增，得到各個循環(huán)的熱流隨時間變化圖。圖1為退火溫度54℃時的變化圖，圖中的溫度曲線A依次指示，a～b：從72℃以200℃/min的速率升溫至94℃，b～c：94℃恒溫0.8min，c～d：從94℃以200 ℃/min的速率降溫至54 ℃，d～e：54 ℃ 恒溫0.8min，e～f：從54℃以200℃/min的速率升溫至72℃，f～h：72℃恒溫0.8min。由圖1可知，b～c高溫變性階段為吸熱過程，而d～e低溫退火和f～h適溫延伸階段為放熱過程，與冉姝等的試驗結果一致［14，15］。曲線B﹑C分別為第2個循環(huán)和第1個循環(huán)的熱流隨時間變化圖，從曲線可以看出PCR體系在b～c﹑d～f﹑f～h恒溫段熱流明顯發(fā)生變化，且曲線B比曲線C變化大。用曲線B減去曲線C得到PCR循環(huán)數(shù)為2和1的熱流差值隨時間變化曲線D，其中，b～c變性吸熱階段的熱焓差值為正，說明第二個循環(huán)比第一個循環(huán)在變性階段吸收的熱量多，而d～c退火﹑f～h延伸放熱階段的熱焓差值為負，說明第二個循環(huán)比第一個循環(huán)在退火﹑延伸階段放出的熱量多，這是由于第二個循環(huán)復制的DNA比第一個循環(huán)的多引起的。用DSC自帶的Pyris Software 5.0軟件采用標準基線得到該循環(huán)的焓值為128.761J/g，同樣的道理，得到不同退火溫度的各個循環(huán)的焓值，用Origin 7.0分析這些數(shù)據(jù)得到不同退火溫度時的焓值隨循環(huán)數(shù)變化圖，見圖2～4。

圖1 退火溫度為55℃時第一個循環(huán)和第二個循環(huán)的熱流變化圖Figure 1 The change of heat flow as cycle number is one when the annealing temperature is 55 ℃

圖2 退火溫度55℃時熱流密度隨循環(huán)數(shù)的變化圖Figure 2 The change of heat flow as cycle number raising when the annealing temperature is 55 ℃

退火溫度的選取對PCR反應的特異性和擴增效率非常重要，一般來說，較低的退火溫度可提高PCR反應的擴增效率但引物與模板間錯配幾率增大，導致擴增特異性較差，而較高的退火溫度則可提高PCR反應的特異性但卻降低了其擴增效率［16］。分析不同退火溫度的變化圖（1～4）可以得出：隨著退火溫度的降低，PCR反應體系的焓值隨循環(huán)數(shù)的增加呈現(xiàn)不同的變化趨勢，其中退火溫度為55℃時，前5個循環(huán)的焓值變化很大，呈對數(shù)型，6～18間有很微弱的變化，但之后的差距變化不是很明顯，出現(xiàn)平臺效應的前移，說明退火溫度較高，引物與模板結合的敏感性較差，導致引物沒有和模板很好地結合，降低PCR的擴展效率，甚至檢測結果呈假陰性；當退火溫度降到54℃時，雖然在0到17個循環(huán)，焓值變化隨循環(huán)數(shù)呈現(xiàn)指數(shù)擴增效應，而17個循環(huán)數(shù)后變化不是很大，平臺效應沒有前移，但平臺期的焓值比較小，說明擴增效率比較低；當退火溫度為53℃時，PCR體系焓值隨循環(huán)數(shù)的增加呈現(xiàn)指數(shù)擴增效應和后期的平臺效應，整個擴增過程的焓值都比較大，說明特異性和擴增效率達到了預期的效果，故應選取退火溫度為53℃。

圖3 退火溫度54℃時熱流密度隨循環(huán)數(shù)的變化Figure 3 The change of heat flow as cycle number raising when the annealing temperature is 54 ℃

圖4 退火溫度53℃時熱流密度隨循環(huán)數(shù)的變化Figure 4 The change of heat flow as cycle number raising when the annealing temperature is 53 ℃

從圖2～4的變化趨勢可以看出，不論退火溫度多少，PCR擴增都要進入“平臺效應”，研究者從酶促擴增動力學的角度進行了相關的研究，可能的原因有：①DNA聚合酶活力的下降：PCR循環(huán)中最重要的因素是Tap－DNA聚合酶，雖然Tap－DNA聚合酶耐高溫不容易失活，但反復長時間暴露在高溫，活力會逐漸降低［17］；②PCR擴增產(chǎn)物濃度的增加，抑制了反應的進行［18，19］；③ 引物二聚體的形成：隨著循環(huán)數(shù)的增加，引物不僅和模板DNA結合，引物和引物間也相互結合形成引物二聚體，形成的引物二聚體不僅減少引物，同時也和ds－DNA競爭引物和dNTP，導致反應速率的降低［20］；④隨著循環(huán)數(shù)的增加，高溫下低濃度ds－DNA變性困難和低溫下模板再退火及退火延伸時間的延長，也會導致擴增效率的下降。PCR擴增是個復雜過程，受到諸多因素的影響，任何因素的微小變化都會很大程度上改變PCR擴增的忠實性和特異性［21］，而開始階段的反應物濃度，熱循環(huán)條件微小變化和錯配對產(chǎn)物的最對總產(chǎn)量影響極大［22］。

3 結論

本試驗利用DSC從量熱學方面研究不同退火溫度對PCR擴增結果的影響，試驗表明：PCR擴增在變性階段吸熱，而在退火和延伸階段放熱，每一個PCR循環(huán)呈現(xiàn)放熱效應；不同退火溫度時的PCR焓值隨循環(huán)數(shù)變化趨勢不同，過高或過低都不能達到預期結果，在本試驗HBV體系中，53℃ 退火時的結果最佳。

1 Williams J G K，Kubelik A R.DNA polymorphism amplified by arbitary primers are useful as genetic markers ［J］.Nucl，Acid Res.，1990，18：6 531～6 535.

2 Weihong Liu，David A Saint.Validation of a quantitative method for real time PCR kinetics［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2002，294：347～353.

3 Scott E Whitney，Alugupally Sudhir，R Michael Nelson，et al.Principles of rapid polymerase chain reaction：mathematical modeling and experimental verification［J］.Computational Biology and Chemistry，2004，28：195～209.

4 You Y，Tataurov A V，Owczarzy R.Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence［J］.Biopolymers，2011，95（7）：472～486.

5 Minetti C A S A，Remeta D P，Miller H，et al.The thermodynamics of template－directed DNA synthesis：base insertion and extension enthalpies［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2003，100：14 719～14 724.

6 Bruylants G，Wouters J，Michaux C.Differential scanning calorimetry in life science：Thermod－ynamics，stability，molecular recognition and application in drug design［J］.Current Medicinal Chemistry，2005，12：2 011～2 020.

7 Hui－Ting Lee，Chris M.Olsen，Lela Waters，et al.Thermodynamic contributions of the reactions of DNA intramolecular structures with their complementary strands［J］.Biochimie，2008，90：1 052～1 063.

8 Concetta Giancola.A convenient tool for studying the stability of proteins and nucleic acids：differential scanning calorimetry［J］.Journal of Thermal Analysis and Calorimetry，2008，91：79～85.

9 Diego Esposito，Pompea Del Vecchio，Guido Barone.A thermodynamic study of herring protamine– DNA complex by differential scanning calorimetry［J］.Phys.Chem.Chem.Phys.，2001，3：5 320～5 325.

10 Brooke N Bourdelat－Parks，Roger M Wartell.Thermodynamic stability of DNA tandem mismatches［J］.Biochemistry，2004，43：9 918～9 925.

11 Hughesman C B，Turner R F B，Haynes C A .Role of the heat capacity change in understanding and modeling melting thermodynamics of complementary duplexes containing standard and nucleobase－modified LNA［J］.Biochemistry，2011，50（23）：5 354～5 368.

12 Goergen B，Meyer Zum，Buschenfeld K H，et al.Mutation specific PCR and direct solid phase sequencing assay for the detection of hepatitis B virus pre－C/C mutants in anti－HBe－positive chronic hepatitis［J］.Med.Virol.，1994，43（1）：97～102.

13 Michael Kleined，Kirsten Schellenberg，Klaus Ritter1.Efficient extraction of viral DNA and viral RNA by the chemagic viral DNA/RNA kit allows sensitive detection of cytomegalo－virus，Hepatitis B Virus，and Hepatitis G Virus by PCR［J］.Journal of Clinical Microbiology，2003，11（52）：5 273～5 274.

14 冉姝，華澤釗，王景宇.聚合酶鏈式反應（PCR）量熱學的實驗研究［J］.工程熱物理學報，2009，3（30）：482～484.

15 周國燕，李紅衛(wèi)，冉姝，等.聚合酶鏈式反應熱流變化的DSC實驗研究［J］.生物學雜志，2010，27（4）：1～4.

16 Rychlik W，Spencer W J，Rhoads R E.Optimization of the annealing temperature for DNA amplificaton in vitro［J］.Nucleic acids reaearch，1990，18：6 409～6 412.

17 James T Hsu，Simantini Das，Satish Mohapatra.Polymerase chain reaction engineering［J］.Biotechnology and Bioengineering，1997，2（55）：359～360.

18 Peter Kainz.The PCR plateau phase－towards an understanding of its limitations［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2000，1 494：23～27.

19 Christy M Waterfall，Robert Eisenthal，Benjamin D Cobb.Kinetic characterisation of primer mismatches in allele－specific PCR：aquantitative assessment［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2002，299：715～722.

20 Simantini Das，Satish C Mohapatra，James T Hsu.Studies on primer－dimer formation in polymerase chain reaction（PCR）［J］.Biotechnology Techniques，1999，13：643～646.

21 Weihong Liu，David A Saint.Validation of a quantitative method for real time PCR kinetics［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2002，294：347～353.

22 D Y Wu，L Ugozzoli，B K Pal，et al.The effect of temperature and oligonucleotide primer length on the specificity and efficiency of amplification by the polymerase chain reaction［J］.DNA Cell Biol.，1991，10：233～238.

Research on changes of PCR enthalpy in different annealing temperature with DSC

ZHOU Guo－yan LAN HaoLI Hong－wei

（Institute of Biosystem Thermal Science，Shanghai University of Science and Technology，Shanghai200093，China）

It is very important to select annealing temperature in PCR process，a little change of the factor may lead to huge impact on thermal phenomenon of PCR.In this paper，the HBV as the target gene in different annealing temperature was replicated，and the enthalpy was studied via DSC，the experiment results show：the denaturation phase of the reaction was endothermic process，and the annealing and extension phase were heat emission process，each circulation presents a exothermic effect；simultaneously high annealing temperature caused platform moving ahead and enthalpy reduction，and be best in 53℃.

PCR；enthalpy；DSC；annealing temperature；cycle number

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.06.006

國家自然科學基金青年基金項目（編號：50206013）；上海市教委科研創(chuàng)新項目（編號：09YZ230）

周國燕（1970－），女，上海理工大學副教授，博士。E－mail：efly＿snow＠163.com

2011－08－01