信號(hào)肽編碼序列庫(kù)的構(gòu)建及耐熱乳糖酶的分泌

夏 雨 弓紫豐 成玉梁 趙 瑩 孫 震

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

信號(hào)肽編碼序列庫(kù)的構(gòu)建及耐熱乳糖酶的分泌

夏 雨 弓紫豐 成玉梁 趙 瑩 孫 震

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

為了實(shí)現(xiàn)來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌的β－半乳糖苷酶在枯草芽孢桿菌中的分泌表達(dá)，建立一種較簡(jiǎn)便的方法篩選能夠分泌該酶的信號(hào)肽，即針對(duì)11種信號(hào)肽構(gòu)建信號(hào)肽編碼序列庫(kù)，采用隨機(jī)篩選方法得到合適的信號(hào)肽，構(gòu)建相應(yīng)的分泌表達(dá)載體和重組表達(dá)菌株。結(jié)果表明，通過信號(hào)肽隨機(jī)篩選方法獲得的枯草芽孢桿菌中性蛋白酶NprE信號(hào)肽能夠有效引導(dǎo)該酶的細(xì)胞外分泌，重組菌株搖瓶培養(yǎng)16h后，上清液中積累的耐熱β－半乳糖苷酶活力達(dá)到64.02U/mL，占該酶所表達(dá)的總酶活力的29.6%。該信號(hào)肽篩選方法可以為微生物蛋白質(zhì)分泌過程中的信號(hào)肽快速選擇和優(yōu)化提供參考。

β－半乳糖苷酶；枯草芽孢桿菌；蛋白質(zhì)分泌；信號(hào)肽

β－半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23）能催化乳糖水解生成葡萄糖和半乳糖，在食品工業(yè)中有重要應(yīng)用。乳品工業(yè)中常采用β－半乳糖苷酶水解牛乳中乳糖，生產(chǎn)低乳糖牛乳以便解決“乳糖不耐癥”問題［1］。目前乳品工業(yè)中使用的β－半乳糖苷酶主要是來源于酵母或霉菌的中溫乳糖酶［2］，最適反應(yīng)溫度在40℃左右，在該溫度下進(jìn)行牛乳中乳糖水解反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)品容易受到微生物污染，因此對(duì)生產(chǎn)工藝有較高的要求；而來源于嗜熱微生物的耐熱β－半乳糖苷酶其最適反應(yīng)溫度一般在55℃以上，采用這類耐熱β－半乳糖苷酶，乳糖水解反應(yīng)可以在較高溫度下進(jìn)行以便減少微生物污染的可能性［2］。

筆者已對(duì)嗜熱脂肪芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus）來源的耐熱β－半乳糖苷酶（BgaB）進(jìn)行了基因克隆、重組表達(dá)、分離純化、固定化和酶學(xué)性質(zhì)等研究［3］，結(jié)果表明該酶的酶學(xué)性質(zhì)非常適合于低乳糖牛乳的生產(chǎn)。為了簡(jiǎn)化重組酶的純化步驟，提高生產(chǎn)效率，工業(yè)上常利用微生物的蛋白質(zhì)分泌功能將細(xì)胞內(nèi)合成的酶蛋白輸出到發(fā)酵上清液［4］。在先前的研究中，筆者在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中嘗試了多種一般分泌途徑（the general secretion pathway，即Sec途徑）信號(hào)肽對(duì)BgaB的分泌，但均未實(shí)現(xiàn)分泌。本試驗(yàn)擬在B.subtilis中嘗試信號(hào)肽隨機(jī)篩選方法來獲得適用于目標(biāo)酶BgaB的信號(hào)肽，即構(gòu)建信號(hào)肽編碼序列庫(kù)并采用信號(hào)肽編碼序列與目標(biāo)基因bgaB的隨機(jī)融合來篩選能夠分泌該酶的信號(hào)肽，以便減少信號(hào)肽嘗試的次數(shù)，提高信號(hào)肽篩選效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備

基因擴(kuò)增儀：GS00001，英國(guó)G－Strom公司；

超聲波破碎儀：VCX－500，美國(guó)Sonics＆Materials公司；

凝膠成像系統(tǒng)：Geldoc 2000，美國(guó)Bio－Rad公司；

回轉(zhuǎn)式恒溫氣浴搖床：ZHWY－2102，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.1.2 試劑

LB培養(yǎng)基各配料：英國(guó)Oxoid公司；

PCR用高保真DNA聚合酶KOD Plus：日本Toyobo（上海）公司；

鄰－硝基苯－β－D－半乳糖吡喃糖苷（ONPG）：上海生工生物工程有限公司；

各限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：美國(guó) MBI Fermentas（中國(guó)）公司；

低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)：上海捷瑞生物工程有限公司；DNA瓊脂糖凝膠電泳膠回收試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；

其它試劑：均為市售分析純。

1.1.3 菌種及培養(yǎng)條件大腸桿菌 （Escherichia coli）DH5α用于分子克隆和質(zhì)粒的構(gòu)建，G.stearothermophilusIAM11001株作為耐熱β－半乳糖苷酶編碼基因bgaB的供體菌株［5］，B.subtilis168株作為分泌表達(dá)宿主菌株。其中DH5α和168菌株于37 ℃培養(yǎng)，G.stearothermophilusIAM11001株于55℃培養(yǎng)。所有菌株的培養(yǎng)均采用Luria－Bertani（LB）培養(yǎng)基，根據(jù)培養(yǎng)菌株的需要，向該培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素（終濃度100μg/mL）或卡那霉素（終濃度50μg/mL）。

1.1.4 質(zhì)粒E.coli中使用的亞克隆載體pUCX05由本研究室構(gòu)建，質(zhì)粒 pMA5是一個(gè)E.coli－B.subtilis穿梭載體［6］，質(zhì)粒pMA5△MCS－lipA 是pMA5的衍生質(zhì)粒［7］，為本研究室構(gòu)建。本試驗(yàn)基于pMA5和pMA5△MCS－lipA構(gòu)建了表達(dá)載體pMA0911.1。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)分子生物學(xué)方法 分子生物學(xué)操作如E.coli感受態(tài)細(xì)胞的制備、質(zhì)粒DNA的抽提及純化、限制性酶切、DNA片段的連接和轉(zhuǎn)化、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、核酸凝膠電泳和蛋白質(zhì)SDS－PAGE電泳等操作按Sambrook等編著的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)［8］進(jìn)行，B.subtilis的感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化按Harwood等編著的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)［9］進(jìn)行。

1.2.2 表達(dá)載體pMA0911.1的構(gòu)建方法 質(zhì)粒pMA5啟動(dòng)子下游無適合本試驗(yàn)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，為了引入更多適用的限制酶位點(diǎn)，本試驗(yàn)對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行了改造。采用限制性內(nèi)切酶NdeI和BamHI對(duì)質(zhì)粒pMA5△MCS－lipA進(jìn)行酶切，回收684bp片段并將其插入質(zhì)粒pMA5的NdeI－BamHI位點(diǎn)之中，得到的重組質(zhì)粒再用限制酶EcoRI進(jìn)行酶切，回收7.2kb片段并進(jìn)行自連接，得到載體命名為pMA0911.1。

1.2.3 枯草芽孢桿菌信號(hào)肽編碼序列庫(kù)的構(gòu)建方法 以B.subtilis168株染色體DNA為模板，分別采用表1中各對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的信號(hào)肽編碼序列片段分別連接到亞克隆載體pUCX05的EcoRV位點(diǎn)，并轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α中得到一組含11種不同信號(hào)肽編碼序列的重組質(zhì)粒。使用時(shí)分別將這些重組質(zhì)粒采用限制酶NdeI－EcoRI雙酶切并回收信號(hào)肽編碼序列，混合至終濃度為5～10ng/μL備用。

1.2.4 耐熱β－半乳糖苷酶基因克隆和分泌表達(dá)載體的構(gòu)建方法 以G.stearothermophilusIAM11001株染色體 DNA作為模板，通過引物 P1（5′－GGGCCCGGAATTCATGAATGTGTTATCCTCAATTTG－3′）和 P2 （5′－GTTAATCGGATCCTCATCAAACCTTCCCGGCTTCATCATG－3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增出2kb左右的目標(biāo)基因bgaB片段，并將其亞克隆到載體pUCX05中，得到pUCX05－bgaB。該重組質(zhì)粒送上海博尚生物技術(shù)有限公司對(duì)bgaB基因進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序驗(yàn)證序列正確后，將該質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI進(jìn)行酶切并回收2kb左右的bgaB基因片段，將該片段插入到質(zhì)粒pMA0911.1的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，所得重組質(zhì)粒命名為pMA0911.1－bgaB。

1.2.5 耐熱β－半乳糖苷酶的表達(dá)和酶活力的檢測(cè) 將構(gòu)建的耐熱β－半乳糖苷酶重組表達(dá)菌株種子液按1%體積比接種于100mL LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，200r/min搖瓶培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第6～16小時(shí)中，每隔1h取適量培養(yǎng)液，于12 000g離心20min后，分別回收發(fā)酵上清液和菌體。細(xì)胞外酶活力檢測(cè)直接采用上清液。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)酶活力檢測(cè)，將菌體用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 6.5）重懸洗滌2次，在冰浴中用超聲波破碎菌體（超聲波功率800W，時(shí)間為30min），細(xì)胞破碎液于12 000g離心30min后回收上清液進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)酶活力的測(cè)定。酶活力按中性乳糖酶活力檢測(cè)方法進(jìn)行［10］，以O(shè)NPG為底物，一個(gè)中性乳糖酶單位定義：在55℃、pH 6.5條件下，每分鐘水解產(chǎn)生1nmol的鄰－硝基苯（ONP）所需酶的量為一個(gè)中性乳糖酶活單位（U）。

2 結(jié)果與討論

2.1 表達(dá)載體pMA0911.1及信號(hào)肽編碼序列庫(kù)的構(gòu)建

質(zhì)粒pMA5原始載體的啟動(dòng)子PHpaII下游僅有NdeI和BamHI兩個(gè)單酶切位點(diǎn)，對(duì)于目標(biāo)基因bgaB及其上游不同信號(hào)肽編碼序列的拼接融合并不方便，因此本試驗(yàn)從質(zhì)粒pMA5出發(fā)構(gòu)建了質(zhì)粒pMA0911.1（圖1），該質(zhì)粒下游新引入了EcoRI、SalI等單酶切位點(diǎn)。

根據(jù)基因組范圍的預(yù)測(cè)結(jié)果，B.subtilis中約有300種可能輸出到細(xì)胞外的蛋白質(zhì)［11］，而蛋白質(zhì)組學(xué)研究［12］表明B.subtilis培養(yǎng)上清液中存在約200種細(xì)胞外蛋白質(zhì)。為了構(gòu)建一個(gè)合適的信號(hào)肽編碼序列庫(kù)，本試驗(yàn)參照文獻(xiàn)［12］的研究結(jié)果，選擇了11種在細(xì)胞外具有較大分泌輸出量的含信號(hào)肽蛋白質(zhì)，按照1.2.3的方法構(gòu)建了信號(hào)肽編碼序列庫(kù)。信號(hào)肽編碼序列的來源及其擴(kuò)增所用引物見表1，擴(kuò)增片段的電泳結(jié)果見圖2。擴(kuò)增片段首先分別亞克隆至質(zhì)粒pUCX05中以便保存，使用時(shí)通過限制性酶切將這些片段回收并按一定比例混合后得到一個(gè)含多種信號(hào)肽編碼序列的庫(kù)。

圖1 質(zhì)粒pMA0911.1圖譜Figure 1 Physical map of plasmid pMA0911.1

圖2 各信號(hào)肽編碼序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 2 The PCR results of the signal peptide coding sequences

2.2 耐熱β－半乳糖苷酶分泌表達(dá)體系的構(gòu)建

從G.stearothermophilusIAM11001株基因組 DNA 出發(fā)，擴(kuò)增出該酶的編碼基因bgaB，并將該基因克隆到質(zhì)粒pMA0911.1中，得到重組質(zhì)粒pMA0911.1－bgaB。為嘗試不同信號(hào)肽對(duì)該酶的分泌表達(dá)效率，將信號(hào)肽編碼序列庫(kù)中的信號(hào)肽編碼序列與pMA0911.1－bgaB的NdeI－EcoRI酶切回收片段相連接，并轉(zhuǎn)化B.subtilis168株感受態(tài)細(xì)胞，從平板上挑取轉(zhuǎn)化子并用引物 P3（5’－ACTTGGAAGTGGTTGCCGGA－3’）和 P4（5’－CTCTGGGTTATAATCTCCTC－3’）對(duì)轉(zhuǎn)化子樣本進(jìn)行菌落PCR，以驗(yàn)證重組B.subtilis轉(zhuǎn)化子所含質(zhì)粒中信號(hào)肽編碼序列是否插入到bgaB基因的上游。

對(duì)300個(gè)轉(zhuǎn)化子樣本進(jìn)行PCR驗(yàn)證，其中約13.5%的轉(zhuǎn)化子為陽(yáng)性，提示這些轉(zhuǎn)化子所含重組質(zhì)粒中可能攜帶信號(hào)肽編碼序列。將40個(gè)陽(yáng)性的PCR樣本進(jìn)行序列測(cè)定，共得到33個(gè)有效測(cè)序結(jié)果，其中9個(gè)為NprE信號(hào)肽編碼序列，13個(gè)為AmyX信號(hào)肽編碼序列，6個(gè)為OppA信號(hào)肽編碼序列，5個(gè)為YweA編碼序列，其余7個(gè)為無效序列。通過信號(hào)肽篩選方法構(gòu)建成功的分泌表達(dá)質(zhì)粒和重組菌株見表2。

表1 信號(hào)肽編碼序列的來源及其擴(kuò)增所用引物Table 1 Origins of the signal peptide coding sequences and the primers for amplification

表2 構(gòu)建的重組分泌表達(dá)質(zhì)粒和菌株Table 2 The secretory expression plasmids and strains constructed

由表2可知，信號(hào)肽編碼序列庫(kù)中的11條序列中有4條成功融合到到目標(biāo)基因bgaB的上游，而其它信號(hào)肽編碼序列未能實(shí)現(xiàn)成功融合。在先前的研究中發(fā)現(xiàn)，某些枯草芽孢桿菌信號(hào)肽編碼序列無法成功融合到基因bgaB上游，推測(cè)這些不成功的例子是由于融合基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)重組菌株具有致死作用，結(jié)合本試驗(yàn)的結(jié)果可以進(jìn)一步推斷，目標(biāo)蛋白質(zhì)與信號(hào)肽之間的配對(duì)是否合理影響到重組菌株能否正常生長(zhǎng)。

2.3 耐熱β－半乳糖苷酶的表達(dá)及活性的檢測(cè)

按照1.2.5的方法對(duì)表2中4株重組菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，并對(duì)培養(yǎng)物細(xì)胞內(nèi)外的耐熱β－半乳糖苷酶活力進(jìn)行了檢測(cè)。搖瓶培養(yǎng)第6～16小時(shí)的各重組菌株細(xì)胞內(nèi)外酶活力隨時(shí)間變化情況見圖3。

圖3 重組菌株細(xì)胞外的BgaB酶活力Figure 3 The extracellular BgaB enzymatic activities from the recombinant strains

由圖3可知，這4株重組菌株都實(shí)現(xiàn)了耐熱β－半乳糖苷酶的表達(dá)，其中重組菌株168（pMA0911－nprE－bgaB）和168（pMA0911－amyX－bgaB）在一定程度上實(shí)現(xiàn)該酶的細(xì)胞外分泌。重組菌株168（pMA0911－oppA－bgaB）和168（pMA0911－yweA－bgaB）培養(yǎng)上清液中無BgaB酶活力，然而該酶在細(xì)胞內(nèi)卻實(shí)現(xiàn)了正常表達(dá)，推測(cè)其原因是OppA信號(hào)肽和YweA信號(hào)肽不適合該酶的細(xì)胞外分泌。在培養(yǎng)的第16小時(shí)，168（pMA0911－nprE－bgaB）菌株所產(chǎn) BgaB的細(xì)胞內(nèi)酶活力為152.01U/mL，細(xì)胞外酶活力為64.02U/mL；故分泌的BgaB酶活力占該菌株表達(dá)的總酶活力的29.6%，而168（pMA0911－amyX－bgaB）菌株細(xì)胞外酶活力較低。

對(duì)這4株重組菌株的培養(yǎng)上清液進(jìn)行了SDS—PAGE電泳檢驗(yàn)，其中168（pMA0911－amyX－bgaB）和168（pMA0911－nprE－bgaB）上清液電泳樣在 67kDa左右有條帶，且分子量大小與預(yù)期相符［5］，而168（pMA0911－oppA－bgaB）和168（pMA0911－yweA－bgaB）上清液沒有明顯條帶（圖4），表明在這一表達(dá)系統(tǒng)中，NprE信號(hào)肽和AmyX信號(hào)肽能夠?qū)gaB分泌到細(xì)胞外，且NprE信號(hào)肽對(duì)于目標(biāo)蛋白質(zhì)BgaB的分泌效率要明顯高于AmyX信號(hào)肽。祝發(fā)明等［13］研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌AmyX信號(hào)肽編碼序列能夠通過B.subtilis的雙精氨酸分泌途徑將G.stearothermophilus來源的耐熱β－半乳糖苷酶分泌到細(xì)胞外，與本試驗(yàn)結(jié)果相符，而NprE信號(hào)肽引導(dǎo)該酶的分泌先前未見報(bào)道。

圖4 重組菌株發(fā)酵上清液的SDS－PAGE蛋白質(zhì)電泳檢驗(yàn)Figure 4 The SDS－PAGE analysis for the supernatants of the recombinant strains

3 結(jié)論

針對(duì)11種枯草芽孢桿菌信號(hào)肽構(gòu)建了信號(hào)肽編碼序列庫(kù)，并采用隨機(jī)篩選的方法得到能夠分泌目標(biāo)蛋白質(zhì)BgaB的信號(hào)肽，其中枯草芽孢桿菌NprE信號(hào)肽和AmyX信號(hào)肽實(shí)現(xiàn)了BgaB的分泌。雖然分泌量尚低，還需要進(jìn)一步篩選或設(shè)計(jì)適合該酶的信號(hào)肽，但本試驗(yàn)構(gòu)建信號(hào)肽編碼序列庫(kù)以及隨機(jī)篩選信號(hào)肽編碼序列的方法能用于各類目標(biāo)蛋白質(zhì)分泌信號(hào)肽的優(yōu)化選擇，具有普遍適用性。

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Construction of a signal peptide coding sequence library and secretion of a thermostableβ－galactosidase

XIA Yu GONG Zi－feng CHEN Yu－liang ZHAO YingSUN Zhen

（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu214122，China）

In order to achieve the extracellular secretion of the thermostableβ－galactosidase fromGeobacillus stearothermophilus，a simple and rapid method was developed in this study for screening of the signal peptide that can direct the secretion of the target enzyme.A signal peptide coding sequence library was constructed according to 11signal peptides，and the proper signal peptide coding sequences were obtained by random selection.The secretion plasmids and the recombinant strains were then constructed.Results showed that the signal peptide of NprE which obtained by random selection can secret the target enzyme properly.After cultivation for 16h，theβ－galactosidase accumulated in the supernatant reached 64.02U/mL，which accounted for 29.6%of the total target enzyme synthesized.The signal peptide screening method developed in this study can be applied for the rapid selection and optimization of signal peptides in other microbial protein secretion systems.

β－galactosidase；Bacillus subtilis；protein secretion；signal peptide

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.06.003

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31000752）；江蘇省基礎(chǔ)研究計(jì)劃（自然科學(xué)基金）（編號(hào)：BK2008103）；教育部博士點(diǎn)基金（編號(hào)：200802951022）

夏雨（1975－），男，江南大學(xué)副教授，博士。E－mail：yuxia＠jiangnan.edu.cn

孫震

2011－06－20