火麻仁粕酶解產(chǎn)物的抗氧化活性研究

林金鶯 安 琪 曾慶祝

（廣州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣東 廣州 510006）

火麻仁粕酶解產(chǎn)物的抗氧化活性研究

林金鶯 安 琪 曾慶祝

（廣州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣東 廣州 510006）

采用Alcalase 2.4L FG酶解火麻仁粕，研究不同酶解條件下酶解物的抗氧化活性。結(jié)果表明，酶解5 h的產(chǎn)物抗氧化效果最好：酶解物對DPPH·、HO·的清除以及對二價鐵離子螯合的EC50分別為1.36，0.62，1.15 mg／m L，雖然比傳統(tǒng)抗氧化劑差，但發(fā)現(xiàn)在抑制油酸過氧化體系中從第5天開始酶解物對油酸的抑制效果優(yōu)于α－生育酚，并且酶解物中游離抗氧化氨基酸高。

火麻仁粕；酶解；抗氧化

火麻仁（cannabis sativa L.）一直以來作為重要的食物和醫(yī)藥原料在中國已經(jīng)使用了數(shù)千年。它含20%～25%蛋白質(zhì)、25%～30%油脂、20%～30%膳食纖維及一系列豐富的維生素和礦物質(zhì)［1］。火麻仁蛋白主要是球蛋白和白蛋白，能滿足人體所需的各種必需氨基酸，其中精氨酸、賴氨酸和谷氨酸的含量較高。研究［2］表明，火麻仁蛋白所含必需氨基酸足以滿足2～5歲兒童生長發(fā)育需要，是一種十分優(yōu)異的植物蛋白新來源。

近年來，全世界對蛋白資源做了較多深入的研究。到目前為止，大豆蛋白［3］、小麥蛋白［4］、玉米蛋白［5］等酶解產(chǎn)物中相繼被發(fā)現(xiàn)含有功能肽，其中大豆多肽、玉米多肽等成功進(jìn)行了產(chǎn)業(yè)化。但火麻仁蛋白目前尚未得到較好的開發(fā)利用。據(jù)報道［6］，Alcalase 2.4 L FG的酶解產(chǎn)物比其它酶的酶解產(chǎn)物具有更強(qiáng)的抗氧化性。故本試驗(yàn)擬利用Alcalase 2.4 L FG酶解火麻仁粕，研究不同酶解條件下酶解物的抗氧化活性，旨為火麻仁粕的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火麻仁種子：廣州市清平批發(fā)市場。除去雜質(zhì)、去皮，在通風(fēng)干燥箱中干燥，粉碎后過0.3～0.425 mm篩，用乙醚抽提油脂后密封，4℃放置備用。

Alcalase 2.4L FG：丹麥諾維信公司；

菲咯嗪、α－生育酚、2，2－二苯基－1－苦基苯肼（DPPH）、油酸：美國凱萊德公司；

水楊酸、三氯乙酸、甲醇：均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠；

BHA：鄭州天龍食品添加劑有限公司；

VC：東北制藥廠。

1.2 主要設(shè)備與儀器

冷凍離心機(jī)：ALLEGRA－64R，梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；

真空冷凍干燥機(jī)：ALPHA 1－2／LD－Plus，德國克萊斯特公司；

高速藥物粉碎機(jī)：WK－400B，山東青州市精誠機(jī)械有限公司；

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF－101SDF－101S，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

紫外分光光度計：UV2300，上海天美科學(xué)儀器有限公司；

高效液相色譜：510型，美國沃特斯公司；

氨基酸分析專用柱：PICO－TAG，美國沃特斯公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 火麻仁粕酶解方法 研究火麻仁粕不同酶解時間的酶解產(chǎn)物對各種自由基的清除能力，以找出最佳的酶解時間。底物濃度5%、Alcalase 2.4LFG濃度為底物濃度的2%、酶解溫度60℃，定容后測定酶解0～6 h后酶解物的各種抗氧化活力，篩選出較合適的酶解時間。然后將最佳酶解時間酶解物冷凍干燥，并測定其EC50值。

1.3.2 測定方法

（1）多肽含量的測定：采用雙縮脲法并作一定的修改。加入等量的三氯乙酸沉淀蛋白后，用0.3 m L樣液并加入2.7 m L顯色劑進(jìn)行測定。

（2）DPPH·清除能力的測定：在Pérez－Jiménez等的方法［7］的基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)修改。0.3 m L的發(fā)酵液添加到2.7 m L0.000 1 mol／L DPPH 新鮮配制的甲醇溶液中，用力搖勻10 s，在黑暗中放置30 min后，用紫外－可見分光光度計在517 nm測定的吸光度，用沒有加樣品的DPPH甲醇溶液作為空白對照，抑制率按式（1）計算：

式中：

R—— 抑制率，%；

Abst＝0—— 空白的吸光度；

Abst＝30min—— 加入水解液后保溫30 min的吸光度。

（3）酶解物與二價鐵離子（Fe2＋）螯合能力的測定：參照Decker等的測定方法［8］。

（4）羥基自由基HO·的清除能力的測定：參照賈之慎等的測定方法［9］。

（5）總還原力的測定：參照Oyaizu等的方法［10］。

（6）酶解物對油酸模型過氧化體系抑制的測定：在Xu等的方法［11］的基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)修改。分別加入1.3 mg酶解物、BHA和α－生育酚于4.7 m L乙醇溶液75%，0.1 m L硫氰酸胺30%，0.1 m L 2×10－2M（用3.5% 鹽酸作溶劑）的FeCl2溶液。3 min后，在500 nm測定吸光度。記下0 min的測定值，然后分別在0～11天每天測定其吸光度。

（7）氨基酸分析：參照Tang等的方法［8］。將樣品酸解后采用HPLC測定。氨基酸檢測條件：PICO－TAG氨基酸分析專用柱，長度150 mm；柱溫38℃，檢測波長254 nm，流速1 m L／min，二元梯度洗脫測定氨基酸。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解時間對酶解物抗氧化活性的影響

Alcalase 2.4L FG酶是堿性蛋白酶，水解能力強(qiáng)，價格較為便宜，是制備生物活性肽的重要酶種。Alcalase酶解火麻仁粕的酶解液在不同時間對自由基的清除能力見表1。

由表1可知，隨著水解時間（1～6 h）的延長，酶解液清除DPPH·的能力越大，但從第4小時起變化不大；酶解物對Fe2＋有很強(qiáng)的螯合力，各時間段的產(chǎn)物對其螯合率都很高，但隨著酶解時間的延長，螯合率增加的趨勢變緩；酶解液清除HO·的能力也是隨著酶解時間的延長而增強(qiáng)，但酶解1 h的酶解液對HO·已經(jīng)有較強(qiáng)的清除能力，在酶解5 h時已經(jīng)達(dá)到最大值，酶解6 h稍微下降，其清除率與其螯合Fe2＋的能力有相同趨勢，這是因?yàn)榭寡趸瘎┣宄鼿O·主要是通過螯合過渡金屬離子來產(chǎn)生作用的［12］。從表1還可以得出，酶解物的總還原力隨著酶解時間的延長而增大，但在酶解5 h后增幅變小。

表1 Alcalase酶解火麻仁粕與自由基清除能力的關(guān)系Table 1 Relationship between hempseed hydrolysate by alcalase and radical scavenging activity

綜合上述的結(jié)果，本試驗(yàn)選擇Alcalase 2.4L FG對火麻仁粕酶解5 h，滅酶后120目過濾，用磁力攪拌機(jī)在95℃蒸發(fā)水分約2 h，然后在－38℃冷凍干燥約5 h，制成粉末，再做進(jìn)一步的比較研究。

2.2 不同濃度酶解物的抗氧化活性

由圖1～4可知，火麻仁粕酶解物的抗氧化活性與劑量正相關(guān)；酶解產(chǎn)物對各種自由基的清除效果比較好，但與傳統(tǒng)的抗氧化劑相比較，有一定的差距。經(jīng)計算得出，酶解物對DPPH·、HO·的清除以及對二價鐵離子螯合的EC50分別為1.36，0.62，1.15 mg／mL。

圖1 不同濃度酶解物對DPPH清除率的影響Figure 1 Effect on DPPH scavenging activity of different hydrolysates concentration

圖2 不同濃度酶解物對鐵離子螯合率的影響Figure 2 Effect on Fe2＋chelating activity of different hydrolysates concentration

圖3 不同濃度酶解物對HO·清除率的影響Figure 3 Effect on HO·radical scavenging activity of different hydrolysates concentration

圖4 不同濃度酶解物對總還原力的影響Figure 4 Effect on reducing power of different hydrolysates concentration

2.3 酶解物對油酸過氧化體系的抑制作用

火麻仁粕酶解物、BHA和α－生育酚對油酸過氧化體系的抑制作用如圖5所示，吸光度值越大，表明研究對象對過氧化體系的抑制作用越差。

由圖5可知，在恒溫試驗(yàn)的11 d中，火麻仁粕酶解物對油酸過氧化體系的抑制作用隨著時間的延長是比較穩(wěn)定的。前4 d，酶解物、BHA和α－生育酚對油酸的氧化抑制能力很接近，但從第5天起，酶解物比α－生育酚表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化作用；因此，火麻仁粕酶解物作為天然抗氧化劑是具有潛在的應(yīng)用價值。

圖5 酶解物對油酸過氧化體系抑制的研究Figure 5 Peroxidation inhibition activity in linoleic acid system of hydrolysate

2.4 酶解物的氨基酸分析

有研究［13］指出，半胱氨酸、組氨酸、色氨酸、賴氨酸、精氨酸、亮氨酸、纈氨酸以及它們的衍生物具有抗氧化性，苯丙氨酸也有抗氧化能力?；鹇槿势擅附馕锏陌被峤M成分析見表2。由表2可知，游離抗氧化氨基酸占總游離氨基酸的53.4%，而多肽中的抗氧化氨基酸占總多肽的35.85%，抗氧化氨基酸總量達(dá)到5 751.63 mg／100 mL。

表2 酶解物的氨基酸組成分析+Table 2 Amino acid composition of hydrolysate

3 結(jié)論

雖然火麻仁粕酶解物抗氧化性比傳統(tǒng)抗氧化劑差，但具有更為安全良好和穩(wěn)定持久的抗氧化能力，酶解物中游離抗氧化氨基酸比多肽中抗氧化氨基酸含量高，因此，可能在食品特別是功能性食品及化妝品等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。

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Research on the antioxidant activity of hydrolysate of hempseed meal

LIN Jin－ying AN QiZENG Qing－zhu

（College of chemistry and chemicals，Guangzhou University，Guangzhou，Guangdong510006，China）

In order to evaluation the radical scavenging activity of hydrolysate of hempseed meal in different hydrolysis period with Alcalase 2.4L FG.The optimal results were as folloued：hydrolysis by Alcalase 2.4L FG for 5 h，EC50value of DPPH·，HO·scavenging activity and Fe2＋chelating ability of hydrolysate were 1.36 mg／m L，0.62 mg／m L，1.15 mg／m L respectively.Although inferior radical scavenging activity than traditional antioxidants，hydrolysate had a better lipid peroxidation inhibition activity thanα－tocopherol from the fifth day.Also，hydrolysate contains higher antioxidant amino acids.

hempseed meal；hydrolysis；antioxidation

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.03.015

林金鶯（1963－），女，廣州大學(xué)副教授，博士。E－mail：8604 69013＠qq.com

2011－02－20