三葉因子Bm-TFF2突變體在原核體系中的表達及促細胞遷移活性

余果宇, 向 陽, 張紅蕓, 江 萍, 李文輝, 張 云, 張 勇,*

(1. 中國科學院昆明動物研究所 動物模型與人類疾病機理重點實驗室, 云南 昆明 650223; 2. 昆明醫(yī)學院 生物化學教研室, 云南昆明 650500; 3. 中國科學院研究生院, 北京 100049; 4. 昆明醫(yī)學院 第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科, 云南 昆明 650032)

三葉因子Bm-TFF2突變體在原核體系中的表達及促細胞遷移活性

余果宇1,2,#, 向 陽1,3,#, 張紅蕓4, 江 萍1, 李文輝1, 張 云1, 張 勇1,*

(1. 中國科學院昆明動物研究所 動物模型與人類疾病機理重點實驗室, 云南 昆明 650223; 2. 昆明醫(yī)學院 生物化學教研室, 云南昆明 650500; 3. 中國科學院研究生院, 北京 100049; 4. 昆明醫(yī)學院 第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科, 云南 昆明 650032)

大蹼鈴蟾三葉因子Bm-TFF2具有較人TFF2更強的促細胞遷移和抗凋亡活性。該研究利用RT-PCR方法擴增得到野生型Bm-TFF2的基因, 然后分別構(gòu)建N端、C端和分子中兩個精氨酸突變的突變體, 最后連接表達載體產(chǎn)生pET32a(+)／Bm-TFF2突變型重組質(zhì)粒, 轉(zhuǎn)入大腸桿菌中, 經(jīng)37 °C培養(yǎng), IPTG誘導, 其融合蛋白主要存在于包涵體中, 用組氨酸標簽的親合柱純化溶解后的包涵體上清, 進一步用 RP-HPLC純化得到硫氧還蛋白(TRX)/Bm-TFF2突變型融合蛋白。通過SDS-PAGE和Western blotting檢測分析其純度和特異性。最終, 從1L培養(yǎng)基中得到20 mg純度為95%的三種重組突變型融合蛋白。三種突變型重組蛋白都具有劑量依賴性的促細胞遷移活性, 并且其活性無顯著差異。該研究為進一步研究Bm-TFF2結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系以及揭示其作用的分子機制奠定了基礎。

Bm-TFF2; 突變體; 表達; 純化; 細胞遷移

三葉因子(trefoil factor, TFFs)是一類含一個或幾個三葉因子結(jié)構(gòu)域的分泌蛋白, 該結(jié)構(gòu)域是一段 38或39個氨基酸的多肽, 其中的六個半胱氨基以1-5, 2-4, 3-6配對的構(gòu)型方式生成三對二硫鍵, 從而形成典型的三葉狀結(jié)構(gòu), 此結(jié)構(gòu)賦予 TFFs家族蛋白耐酸、堿和蛋白酶水解的性質(zhì), 同時也是其行使功能所必需的。人TFFs包括含一個三葉因子結(jié)構(gòu)域、 與乳腺癌相關(guān)的多肽(TFF1或 PS2)和小腸三葉因子(TFF3或ITF)以及含兩個結(jié)構(gòu)域的解痙攣多肽(SP或TFF2)。TFFs在黏膜防御、修復和再生等過程中通過促進細胞增殖、細胞遷移和對抗細胞凋亡等過程發(fā)揮重要作用(Baus-Loncar et al, 2005; Dignass et al, 1994; Oertel et al, 2001; Taupin et al, 2000)。此外, TFFs在多種腫瘤中表達異常的事實提示, 它們廣泛參與腫瘤細胞增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移過程(Cook et al, 1999; Fox et al, 2007; Lalani et al, 1999; Siu et al, 2004)。同時, TFF2表達的增加還常常相關(guān)于腫瘤的發(fā)展以及不良預后(Dhar et al, 2003; Emami et al, 2004; Katoh, 2003)。Bm-TFF2是從大蹼鈴蟾皮膚分泌物中獲得的一種具有血小板激動活性的兩棲類三葉因子(Zhang et al, 2005), 進一步的研究又發(fā)現(xiàn)天然Bm-TFF2以濃度依賴的方式促進人AGS、HT-29以及小鼠腸上皮細胞IEC-6的遷移, 并且ERK1/2活性的激活是其發(fā)揮促細胞遷移活性的關(guān)鍵。同時, Bm-TFF2還具有對抗C2-丙烯酰胺引發(fā)的細胞凋亡作用, 從而促進細胞的增殖。這些結(jié)果提示, Bm-TFF2通過MAPK途徑促進細胞遷移并抑制細胞凋亡是其發(fā)揮傷口修復功能的基礎(Chatterjee et al, 2010)。在進一步對重組Bm-TFF2進行結(jié)構(gòu)與功能研究時, 我們發(fā)現(xiàn)全長和單結(jié)構(gòu)域的 Bm-TFF2都具有促細胞遷移和傷口修復活性, 但抗細胞凋亡活性卻是全長依賴的, 即 Bm-TFF2的兩個單結(jié)構(gòu)域剪切體都無抗細胞凋亡活性(Canas et al, 2009), 提示Bm-TFF2的不同活性需要不同的結(jié)構(gòu)基礎。所以, 我們在表達了 Bm-TFF2全長和單結(jié)構(gòu)域的基礎上, 利用基因工程的原理和技術(shù), 分別構(gòu)建和表達了 Bm-TFF2的三個突變體, 并進而檢測和分析了它們的促細胞遷移活性, 這為更加深入地揭示 Bm-TFF2的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系以及分析可能的分子作用機制奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌 DH5α、BL21(DE3)、表達載體pET-32a(+)購于德國 Novagen公司; 逆轉(zhuǎn)錄酶(RNAase H)、限制性內(nèi)切酶KpnI和EcoR I、PCR聚合酶、T4 DNA連接酶和克隆載體 pMD-19T simple、PrimeScript Reverse Transcriptase購于大連寶生物公司; 動物組織總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒購于北京天根生物科技公司; QuikChange? Site-Directed Mutagenesis Kit為STRATAGENE公司產(chǎn)品; 組氨酸選擇的鎳親合層析膠購于Sigma; 蛋白定量試劑盒購于Bio-Rad; 辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔和山羊抗鼠血清購自美國Santa Cruz生物科技公司; Bm-TFF2多克隆抗血清為實驗室免疫兔所得; 三氟乙酸(TFA)、乙氰(ACN)為德國Merck公司產(chǎn)品; C4色譜柱為大連依利特分析儀器有限公司產(chǎn)品; ECL化學發(fā)光試劑盒為德國Thermo scientific公司產(chǎn)品; AGS細胞系來自于美國的 American Type Culture Collection; Millicells為美國Millipore公司產(chǎn)品; 其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

表1 BM-TFF2突變體的引物序列Tab. 1 The primer sequences of BM-TFF2 mutants

1.2.1 pET-32a(+)/突變型Bm-TFF2重組質(zhì)粒的構(gòu)建取大蹼鈴蟾皮膚組織約20 mg, 按總RNA提取試劑盒說明提取組織總 RNA(TRNA), 并用分光光度計和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和完整性。取一定量的總RNA, 用Oligo(dT)和PrimeScript Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR引物由上海生工生物工程公司合成, 各突變體的引物序列見表1。各突變體的正向引物序列都包括KpnI酶切位點(斜體)和對應的N端5個氨基酸序列(黑體), 反向引物序列包括EcoR I酶切位點(斜體)、 終止子(下劃線)和相應C端的5個氨基酸序列(黑體)。N端突變體(記為BNM)缺乏N端起始的4個氨基酸, C端突變體(記為BCM)缺乏C端的5個氨基酸。以Bm-TFF2的cDNA為模板, 按照95 °C預變性4 min, 94 °C變性30 s, 60 °C退火30 s, 72 °C延伸30 s, 進行35個循環(huán), 最后72 °C延伸7 min獲得PCR產(chǎn)物, 產(chǎn)物通過TA克隆與pMD-19T simple克隆載體連接形成pMD-19T/Bm-TFF2突變型重組質(zhì)粒, 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 DH5α。次日, 挑出經(jīng)藍白斑篩選的白色克隆并用克隆載體的通用引物M13-47和RV-M行菌落PCR檢測。抽提陽性克隆質(zhì)粒, 用KpnI/EcoR I雙酶切后再與相同酶切后的 pET-32a(+)連接形成pET-32a(+)/Bm-TFF2突變型重組質(zhì)粒, 轉(zhuǎn)化BL21(DE3)并用表達載體的通用引物 S.Tag和T7-Ter行菌落 PCR檢測生長的克隆并將陽性克隆測序。構(gòu)建精氨酸突變體的(記為BAM)正向引物序列：5'-tgctgttttatttcagcaatcgtcaatacaatttggtgctttaaacttaa a-3'; 反向引物序列：5'-tttaagtttaaagcaccaaattgtatttct ccttgctgaaataaaacagca-3'。按照 QuikChange?Site-Directed Mutagenesis Kit 進行操作并測序確認兩個精氨酸已經(jīng)突變?yōu)楫惲涟彼岷屠i氨酸。再以該突變質(zhì)粒為模板, 用BAM的引物擴增, 同上方法操作即可得精氨酸突變的表達載體。

1.2.2 重組融合蛋白在大腸桿菌中的表達與純化分別挑取測序正確的N端、C端突變以及第44和45位精氨酸各突變?yōu)楫惲涟彼岷屠i氨酸的單克隆于5 mL LB培養(yǎng)基, 37 °C, 140 r/min搖過夜。次日晨, 取過夜菌液1 mL接種到1 L含100 μg/mL氨芐青霉素的 LB培養(yǎng)瓶, 相同條件下, 搖菌液至 OD 600為0.6, 加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.5 mmol/L, 37 °C誘導4 h。收集菌液, 8 000 g離心10 min獲得細胞沉淀。將沉淀懸浮于100 mL冰冷的含0.3 mol/L NaCl、10 mmol/L咪唑、pH8.0的50 mmol/L磷酸鹽溶液中, 冰浴中用超聲波細胞粉碎機(JY92-2D, 寧波新芝生物科技有限公司)以350 W工作60個循環(huán)(工作6 s, 間歇10 s)。4 °C, 15 000g離心30 min, 棄上清, 收集包涵體部份并用Equilibration Buffer(含8 mol/L尿素, 100 mmol/L磷酸鹽溶液, pH:8.0)常溫溶解4 h, 16 000 r/min, 離心30 min, 取上清并用組氨酸選擇的鎳親合層析柱純化。10倍體積的Washing Buffer(含8 mol/L尿素, 100 mmol/L磷酸鹽溶液, pH:6.3)洗脫結(jié)合鎳柱的非特異性蛋白, 最后用Elution Buffer(含8 mol/L尿素, 100 mmol/L磷酸鹽溶液, pH:5.0)洗脫結(jié)合在鎳柱上的融合蛋白。收集洗脫液并用含6 mol/L尿素的生理磷酸鹽溶液于4 °C進行梯度透析, 直至最后用無尿素的生理磷酸鹽溶液透析三次, 收集透析液超濾濃縮, 用膠濃度為12%的SDS-PAGE并行考馬斯亮藍染色分析重組融合蛋白的純化過程。RP-HPLC對超濾濃縮的蛋白液進一步純化。操作如下：選用C4色譜柱(Zorbax 300 SB C4column, 4×300 mm), 將樣品分別上樣于預先用含 0.1%TFA的超純水平衡好的C 4柱, 待穿透峰流出后, 用含0.1%TFA的ACN進行線性梯度洗脫。

1.2.3 重組融合蛋白的鑒定 收集280 nm對應的最高洗脫峰, 抽干TFA和ACN后, 凍干和溶解樣品,蛋白定量試劑盒定量。各取等量的 TRX-BNM、TRX-BCM和TRX-BAM融合蛋白行SDS-PAGE (12%)。同時, 遵從Western blotting的操作過程, 將SDS-PAGE膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜, 分別用稀釋3 000倍的抗Bm-TFF2(實驗室免疫家兔制備所得)以及抗TRX抗體(Invitrogen, USA)4 °C反應過夜,再用5 000倍稀釋的山羊抗兔和山羊抗鼠血清常溫下反應1 h, 化學發(fā)光法檢測重組融合蛋白的特異性。

1.2.4 突變型融合蛋白的促細胞遷移活性 用包括有10%胎牛血清(FCS)、100 U/mL青霉素、 100 mg/mL鏈霉素的DMEM和Ham’s F 12 (1:1)培養(yǎng)基于37 °C, 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人胃癌上皮細胞系AGS。待細胞生長狀況良好時, 更換細胞培養(yǎng)液,即用無血清的DMEM和Ham’s F 12(1:1)饑餓細胞24 h, 再采用Boyden Chamber(Chemicon, 美國)系統(tǒng)測定細胞遷移活性(Liu et al, 2008)。具體操作如下：膠原(10 μg/cm2)均勻包埋Millcells底部膜的上室面, 取饑餓的過夜細胞, 在每個上室里加入約1.0×105的 AGS, 下室中加入激動劑, 包括 100 nmol/L或 200 nmol/L重組突變型融合蛋白、 10 nmol/L的生長因子作為陽性對照, 100 nmol/L或200 nmol/L重組的 TRX作為陰性對照, 37 °C、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。18 h后, 用槍頭和棉簽完全移走上室面沒有遷移的細胞, 再用含 2%無水乙醇, 0.1 mol/L硼酸(pH: 9.0)配制的0.025%的結(jié)晶紫染色液室溫下對細胞染色30 min, 10%的乙酸洗脫結(jié)合的結(jié)晶紫, 在 586 nm波長下讀取各實驗組的吸光度值, 并計算比較不同激動劑的遷移率。以上實驗重復3次。

2 結(jié) 果

2.1 pET-32a(+)/突變型Bm-TFF2表達質(zhì)粒的構(gòu)建

提取來源于大蹼鈴蟾皮膚組織的總 RNA, RT-PCR后分別用對應的突變引物擴增得到BAM、BNM和BCM約310 bp的目的片段(圖1 A), 并與pMD-19T載體連接后轉(zhuǎn)化DH5α。, 將雙酶切陽性克隆質(zhì)粒所得的BAM、BNM和BCM基因片段分別連接表達載體 pET-32a(+)形成重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化BL21。選擇測序正確的陽性克隆, 并用KpnI和EcoR I同時酶切pET-32a(+)/BAM、BNM和BCM重組質(zhì)粒, 其檢測結(jié)果如圖1 B所示, 三種突變型重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后都在相對分子質(zhì)量為310 bp的位置出現(xiàn)條帶, 表明3個突變體分別連接到表達載體的相應位置。

2.2 重組融合蛋白在大腸桿菌中的表達和純化

圖1 以大蹼鈴蟾cDNA為模板擴增所得的Bm-TFF2突變體的PCR產(chǎn)物Fig. 1 The identification of the Bm-TFF2 mutant recombinant plasmids by taking the cDNA of Bombina maxima as a template

圖2 重組Bm-TFF2突變體的構(gòu)建與純化Fig. 2 Expression and purification the recombinant Bm-TFF2 mutant proteins

測序方法分別檢測每種Bm-TFF2突變體單克隆的正確性。如圖2 A所示, BNM的突變是N端缺失了4個起始氨基酸——GFPI; 而BCM的突變是C端缺失了4個終末氨基酸——KPQE; BAM的突變則發(fā)生在分子中第44和45位精氨酸上, 兩者分別突變?yōu)楫惲涟彼岷屠i氨酸。將測序正確的各突變體克隆分別接種于1 L LB培養(yǎng)基中, 37 °C, IPTG誘導4 h, 如圖2 B所示, 2道菌液中相對分子質(zhì)量為33 000的位置出現(xiàn)一條顏色深而粗的誘導條帶, 提示誘導后融和蛋白的表達量顯著增加, 并且每種融和蛋白在超聲破碎后的菌液上清中含量較少(3道), 而主要存在于菌液沉淀, 即包涵體中(4道)。充分溶解包涵體并將離心后的包涵體上清結(jié)合組氨酸選擇的鎳親合層析柱, 含8 mol/L尿素, pH:5.0的磷酸鹽溶液能洗脫與親合柱結(jié)合的蛋白部分, 其純度可達70%(5道)。為得到高純度的重組蛋白, RP-HPLC進一步純化透析后的洗脫液, 當洗脫梯度為 70%時, 280 nm 對應的最高洗脫峰即為純化的突變型Bm-TFF2重組融合蛋白, 如圖2 C箭頭所示。

2.3 重組融合蛋白的鑒定

收集各樣品在 280 nm處對應的最高洗脫峰,抽干TFA和ACN, 以及凍干和溶解樣品。各蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分析后都在相對分子質(zhì)量為33 k的地方出現(xiàn)明顯的單一條帶, 其純度高達95%(圖3 A)。抗Bm-TFF2抗體(圖3 B)以及抗TRX抗體(圖3 C)對各重組蛋白進行Western blotting檢測都在相對分子質(zhì)量為33 000的位置出現(xiàn)特異性的反應條帶,表明純化所得的蛋白即為原核體系構(gòu)建表達的突變型Bm-TFF2重組蛋白。

圖3 SDS–PAGE和Western blotting分析重組蛋白Fig. 3 SDS–PAGE and Western blotting analysis of the recombinant proteins

2.4 突變型融合蛋白的促細胞遷移活性

促進黏膜細胞再生是三葉因子蛋白的重要功能之一(Taupin and Podolsky, 2003), 而上皮細胞的遷移又是黏膜再生的重要保障。三種突變型Bm-TFF2重組蛋白處理AGS細胞16 h后, 細胞遷移活性明顯增強并且呈劑量依賴性, 即100 nmol/L和 200 nmol/L重組蛋白的促細胞遷移活性呈逐漸增強的趨勢, 并且200 nmol/L的細胞遷移活性大約是100 nmol/L的兩倍。TRX陰性對照的活性變化無統(tǒng)計學意義, 10 nmol/L的陽性對照-EGF與TRX相比具有顯著的促細胞遷移活性(圖4)。

圖4 重組Bm-TFF2突變體的促細胞遷移活性Fig. 4 The activity of epithelial cell migration of recombinant Bm-TFF2 mutant proteins

3 討 論

三葉因子蛋白在大蹼鈴蟾皮膚中有兩種存在形式。一種是由三個結(jié)構(gòu)域組成的βγ-CAT的β亞基, βγ-CAT是非晶狀體βγ-crystallin和三葉因子蛋白形成的復合物, 具有促細胞遷移和引發(fā)細胞凋亡的活性; 另一種是由兩個結(jié)構(gòu)域組成, 具有促細胞遷移和細胞增殖活性的 Bm-TFF2(He et al, 2008; Liu et al, 2008)。近期研究又發(fā)現(xiàn)重組Bm-TFF2全長以及它的兩個單結(jié)構(gòu)域都有促細胞遷移活性, 并且全長 Bm-TFF2還具有抗細胞凋亡活性, 而它的兩個單結(jié)構(gòu)域則無此活性, 提示 Bm-TFF2活性的發(fā)揮依賴不同的結(jié)構(gòu)基礎(Yu et al, 2010)。該項研究通過比較Bm-TFF2和人TFF2蛋白的氨基酸組成發(fā)現(xiàn), Bm-TFF2在40～50位的氨基酸組成中由兩個具有親水性的精氨酸替代了人TFF2中相應位置的疏水性氨基酸, 推測兩個精氨酸是其發(fā)揮生物學活性的關(guān)鍵, 而且這一區(qū)域又常常是 TFF蛋白中受體/配體結(jié)合的重要部位(Polshakov et al, 1997; Zhang et al, 2005)。另外, Bm-TFF2在其N端和C端序列組成中也出現(xiàn)了與人 TFF2較大的差異。為此, 我們分別對其分子中的兩個精氨酸以及N端和C端序列進行了突變并檢測各種突變體的促細胞遷移活性。因此, 該項研究立足于在體外建立原核表達體系以表達 Bm-TFF2突變體并研究其結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。由于原核表達體系是一種較為經(jīng)濟和方便的手段, 加之表達量大的優(yōu)點, 所以選用 pET-32a(+)體系在大腸桿菌中表達 Bm-TFF2突變體。pET-32a(+)表達重組蛋白時, 其顯著的特點是其融合蛋白部份-TRX能夠增強目的蛋白的溶解性, 并且有助于分子中二硫鍵的正確生成(LaVallie et al, 1993; Stewart et al, 1998)。同時, 由于表達的融合蛋白帶有6個組氨酸, 所以很容易用組氨酸標簽的親合柱來進行純化。我們選用原核體系表達N端和C端, 分別缺失 4個氨基酸的 TRX-BNM 和TRX-BCM 突變體以及分子中兩個精氨酸突變的TRX-BAM突變體(圖2 A)。在表達重組融合蛋白時,如圖2 B所示, IPTG誘導后的菌液出現(xiàn)明顯的相對分子質(zhì)量為 33 000的誘導條帶, 這與先前野生型Bm-TFF2的表達相似, 但突變型的Bm-TFF2由于分子組成的改變使得誘導蛋白主要存在于菌液沉淀中, 這與野生型 Bm-TFF2的誘導表達有所差異,后者的誘導蛋白主要存在于菌液上清(Yu et al, 2010)。溶解的包涵體上清經(jīng)組氨酸選擇的親合柱純化后可得到純度達 70%的融合蛋白, 再用RP-HPLC進一步純化能夠使目的蛋白的純度達95%(圖3 A)?？笲m-TFF2抗體(圖3 B)以及抗TRX抗體(圖 3 C)證實了三種重組蛋白的特異性, 結(jié)果顯示在相對分子質(zhì)量為 33 000 的位置出現(xiàn)反應條帶, 表明純化所得的蛋白即為原核體系構(gòu)建表達的突變型Bm-TFF2重組蛋白。在獲得重組蛋白后, 我們進一步對其活性進行了分析?；谌~因子的重要功能之一是促進黏膜細胞的再生, 而這一功能的完成與細胞遷移活性相關(guān)(Taupin & Podolsky, 2003)。同時通過促進黏膜邊緣細胞的遷移來發(fā)揮傷口修復和治愈的功能(Dignass et al, 1994; Oertel et al, 2001)。因此, 我們檢測了三種突變型Bm-TFF2重組蛋白的促細胞遷移活性。結(jié)果提示在作用濃度為100～200 nmol/L時, 三種突變型的Bm-TFF2都具有明顯的促 AGS細胞遷移活性, 并且這一活性具有劑量依賴性, 即200 nmol/L重組蛋白的促細胞遷移活性顯著性高于100 nmol/L, 大約是其活性的兩倍。同時, 在相同濃度作用下, 無外源蛋白插入的空載體-硫氧還蛋白的促細胞遷移活性卻不明顯。與TRX相比, 10 nmol/L的EGF卻具有顯著的促細胞遷移活性。更為有趣的是, 三種突變型重組蛋白的促細胞遷移活性之間無明顯差異, 并且與重組野生型 Bm-TFF2全長以及兩個單結(jié)構(gòu)域的促細胞遷移活性之間亦無顯著差異。由以上結(jié)果可以推論, Bm-TFF2的N端、C端和分子中兩個精氨酸的突變體, 甚至是單結(jié)構(gòu)域的 Bm-TFF2都不影響它的促細胞遷移活性, 而這一活性, 是Bm-TFF2發(fā)揮傷口修復功能的最基本要素之一。事實上, 三葉因子家族蛋白在胃腸道粘膜的保護和修復過程中發(fā)揮著重要功能。它們能與表皮生長因子(EGF)及轉(zhuǎn)化生長因子 α(TGFα)協(xié)同作用, 參與損傷組織的上皮重建, 即促進受損黏膜周圍完好的上皮細胞向損傷黏膜表面遷移覆蓋, 從而促進損傷黏膜的修復(Wong et al, 1999)。ERK1/2的磷酸化常常為細胞遷移活性所必需并且也是TFFs調(diào)節(jié)信號的關(guān)鍵(Klemke et al, 1997)。研究報道TFFs肽能夠促進支氣管上皮細胞BEAS-2B的遷移, 而這一活性, 是依賴蛋白激酶C(PKC)和胞外信號調(diào)節(jié)激酶-ERK1/2的激活, 即ERK1/2的磷酸化(Chwieralski et al, 2004)。

總之, 我們用原核表達體系 pET32a(+)成功表達出三種 Bm-TFF2的突變型重組蛋白, 并用組氨酸選擇的親合柱和RP-HPLC進行純化, SDS-PAGE和 Western blotting檢測了重組蛋白的純度和特異性, 進而用重組蛋白檢測了它們的促細胞遷移活性,結(jié)果提示三種突變型 Bm-TFF2重組蛋白都具有劑量依賴性的促細胞遷移活性, 并且其活性之間無明顯的差異。這為揭示 Bm-TFF2的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系以及解釋其作用的分子機制提供了有力的依據(jù), 也為進一步開辟TFFs的生物制藥途徑奠定了基礎。

Baus-Loncar M, Kayademir T, Takaishi S, Wang T, 2005. Trefoil factor family 2 deficiency and immune response [J].Cell Mol Life Sci, 62(24): 2947-2955.

Canas M, Moran Y, Rivero MB, Bohorquez A, Villegas V, Rendon Y, Ramirez E, Valderrama E, Briceno Z, Chiurillo MA, 2009. Interleukin-1 genetic polymorphism: association with gastric cancer in the high-risk Central-Western population of Venezuela [J].Rev Med Chil, 137(1): 63-70.

Chatterjee DK, Gnanasammandhan MK, Zhang Y, 2010. Small upconverting fluorescent nanoparticles for biomedical applications [J].Small, 6(24): 2781-2795.

Chwieralski CE, Schnurra I, Thim L, Hoffmann W, 2004. Epidermal growth factor and trefoil factor family 2 synergistically trigger chemotaxis on BEAS-2B cells via different signaling cascades [J].Am J Respir Cell Mol Biol, 31(5): 528-537.

Cook GA, Familari M, Thim L, Giraud AS, 1999. The trefoil peptides TFF2 and TFF3 are expressed in rat lymphoid tissues and participate in the immune response [J].FEBS Lett, 456(1): 155-159.

Dhar DK, Wang TC, Maruyama R, Udagawa J, Kubota H, Fuji T, Tachibana M, Ono T, Otani H, Nagasue N, 2003. Expression of cytoplasmic TFF2 is a marker of tumor metastasis and negative prognostic factor in gastric cancer [J].Lab Invest, 83(9): 1343-1352.

Dignass A, Lynch-Devaney K, Kindon H, Thim L, Podolsky DK, 1994. Trefoil peptides promote epithelial migration through a transforming growth factor β-independent pathway [J].J Clin Invest, 94(1): 376-383.

Emami S, Rodrigues S, Rodrigue CM, Le Floch N, Rivat C, Attoub S, Bruyneel E, Gespach C, 2004. Trefoil factor family (TFF) peptides and cancer progression [J].Peptides, 25(5): 885-898.

Fox JG, Rogers AB, Whary MT, Ge Z, Ohtani M, Jones EK, Wang TC, 2007. Accelerated progression of gastritis to dysplasia in the pyloric antrum of TFF2 -/- C57BL6 x Sv129 Helicobacter pylori-infected mice [J].Am J Pathol, 171(5): 1520-1528.

He YY, Liu SB, Lee WH, Zhang Y, 2008. Melanoma cell growth inhibition by βγ-CAT, which is a novel non-lens βγ-crystallin and trefoil factor complex from frogBombina maximaskin [J].Toxicon, 52(2): 341-347.

Katoh M, 2003. Trefoil factors and human gastric cancer (review) [J].Int J Mol Med, 12(1): 3-9.

Klemke RL, Cai S, Giannini AL, Gallagher PJ, de Lanerolle P, Cheresh DA, 1997. Regulation of cell motility by mitogen-activated protein kinase [J].J Cell Biol, 137(2): 481-492.

Lalani EN, Williams R, Jayaram Y, Gilbert C, Chaudhary KS, Siu LS, Koumarianou A, Playford R, Stamp GW, 1999. Trefoil factor-2, human spasmolytic polypeptide, promotes branching morphogenesis in MCF-7 cells [J].Lab Invest, 79(5): 537-546.

LaVallie ER, DiBlasio EA, Kovacic S, Grant KL, Schendel PF, McCoy JM, 1993. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in theE. colicytoplasm [J].Biotechnology: N Y, 11(2): 187-193.

Liu SB, He YY, Zhang Y, Lee WH, Qian JQ, Lai R, Jin Y, 2008. A novel non-lens βγ-crystallin and trefoil factor complex from amphibian skin and its functional implications [J].PLoS One, 3(3): e1770.

Oertel M, Graness A, Thim L, Buhling F, Kalbacher H, Hoffmann W, 2001. Trefoil factor family-peptides promote migration of human bronchial epithelial cells: synergistic effect with epidermal growth factor [J].Am J Respir Cell Mol Biol, 25(4): 418-424.

Polshakov VI, Williams MA, Gargaro AR, Frenkiel TA, Westley BR, Chadwick MP, May FE, Feeney J, 1997. High-resolution solution structure of human pNR-2/pS2: a single trefoil motif protein [J].J Mol Biol, 267(2): 418-432.

Siu LS, Romanska H, Abel PD, Baus-Loncar M, Kayademir T, Stamp GW, Lalani el N, 2004. TFF2 (trefoil family factor2) inhibits apoptosis in breast and colorectal cancer cell lines [J].Peptides, 25(5): 855-863.

Stewart EJ, Aslund F, Beckwith J, 1998. Disulfide bond formation in theEscherichia colicytoplasm: anin vivorole reversal for the thioredoxins [J].EMBO J, 17(19): 5543-5550.

Taupin D, Podolsky DK, 2003. Trefoil factors: initiators of mucosal healing [J].Nat Rev Mol Cell Biol, 4(9): 721-732.

Taupin DR, Kinoshita K, Podolsky DK, 2000. Intestinal trefoil factor confers colonic epithelial resistance to apoptosis [J].Proc Natl Acad Sci USA, 97(2): 799-804.

Wong WM, Poulsom R, Wright NA, 1999. Trefoil peptides [J].Gut, 44(6): 890-895.

Yu G, Zhang Y, Xiang Y, Jiang P, Chen Z, Lee W, 2010. Cell migrationpromoting and apoptosis-inhibiting activities of Bm-TFF2 require distinct structure basis [J].Biochem Biophys Res Commun, 400(4): 724-728.

Zhang J, Zhang Y, Wan SG, Wei SS, Lee WH, 2005. Bm-TFF2, a trefoil factor protein with platelet activation activity from frogBombina maximaskin secretions [J].Biochem Biophys Res Commun, 330(4): 1027-1033.

Expression of Bm-TFF2 mutants inEscherichia coliand their cell migration-promoting activity

YU Guo-Yu1,2,#, XIANG Yang1,3,#, ZHANG Hong-Yun4, JIANG Ping1, LEE Wen-Hui1, ZHANG Yun1, ZHANG Yong1,*

(1.Key Laboratory of Animal Models and Human Disease Mechanisms, Kunming Institute of Zoology,the Chinese Academy of Sciences,Kunming Yunnan650223,China; 2.Biochemistry Section of Kunming Medical College,Kunming Yunnan650500,China; 3.Graduate School of the Chinese Academy of Sciences,Beijing100039,China; 4.Department of Obstetrics and Gynecology,the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Kunming Yunnan650032,China)

Bm-TFF2, a trefoil factor from the large-webbed bell toad (Bombina maxima), can stimulate cell migration and inhibit cell apoptosis. To study the structure-function relationship of Bm-TFF2, we constructed wild-type and mutated Bm-TFF2 plasmids and expressed recombinant proteins inE. coli. The wild-type Bm-TFF2 gene encoding mature peptide was obtained by RT-PCR, while the N-terminal, C-terminal and two arginine mutated Bm-TFF2 clones were constructed, and ligated into pET-32a(+) expression vectors. The fusion proteins were induced by IPTG at 37°C. The mutant Bm-TFF2 fusion proteins expressed mainly in the inclusion bodies. The mutant (TRX)/Bm-TFF2 could be purified by using Ni2+-chelating chromatography and reverse-phase HPLC from the inclusion body supernatant. The fusion proteins were analyzed by SDS-PAGE and Western blotting. The yield of mutant Bm-TFF2 fusion proteins of above 95% purity was about 20 mg/L. All three recombinant mutant proteins can promote the migration of AGS cells in a dose-dependent manner with no obvious activity difference.

Bm-TFF2; Mutant; Expression; Purification; Cell migration

余果宇(1972-), 女, 博士，研究方向為胃腸腫瘤的分子生物學; 向陽(1983-), 男, 博士生，研究方向為胃腸腫瘤的細胞生物學

Q786; Q959.53

A

0254-5853-(2011)04-0379-07

10.3724/SP.J.1141.2011.04379

2011-01-05；接受日期：2011-05-18

中國科學院“西部之光”(Y102291081); “973”項目(2010CB529800); 國家基金委面上項目(30870304)

?通訊作者(Corresponding author)，E-mail: Tel: 0871-5194279, E-mail: zhyong@mail.kiz.ac.cn

#共同第一作者(Authors contributed equally to the work)