微生物發(fā)酵生產(chǎn)水蘇糖培養(yǎng)基的優(yōu)化＊

張敏,張金澤,段素芳,高加濤,王雪

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京,100027)

微生物發(fā)酵生產(chǎn)水蘇糖培養(yǎng)基的優(yōu)化＊

張敏,張金澤,段素芳,高加濤,王雪

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京,100027)

通過 Plackett-Burman設(shè)計和響應(yīng)面分析對微生物發(fā)酵提純水蘇糖的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化。通過 Plackett-Burman設(shè)計從 6個因素中篩選出了有顯著影響的酵母浸膏、酪蛋白胨和硝酸鈉 3個因素;通過最陡爬坡和 Boxbohnken設(shè)計進一步優(yōu)化,并利用Minitab軟件進行回歸分析,得到以上 3個因素的適宜濃度分別為 (g/L):酵母膏 13.8、酪蛋白胨 8.2、硝酸鈉 4.8。采用優(yōu)化的培養(yǎng)基下,水蘇糖純度由 85%提高到 91%。

響應(yīng)面法,發(fā)酵,提純,水蘇糖

水蘇糖是唇形科水蘇屬植物中天然存在的能顯著促進人體腸道有益菌群增殖的功能性低聚糖,被譽為“天然超強雙歧因子”[1]。水蘇糖還可以間接的增加B族維生素的合成量,降低血液中的膽固醇含量,并使人體免疫性能得到改善,對防治便秘、保肝護肝、調(diào)節(jié)人體代謝等有重要保健作用[2-5]。水蘇糖從我國特有傳統(tǒng)蔬菜草石蠶等植物中提取,具有綠色健康、使用量低等優(yōu)點,市場發(fā)展前景廣闊。因此,近年來水蘇糖的提取研究受到廣泛的關(guān)注。與傳統(tǒng)的物理提取工藝相比,采用發(fā)酵法從天然植物中直接提純水蘇糖,針對微生物對不同糖源利用的特殊性,接種特定的菌種,水蘇糖純度可由 74%升至 85%左右。在已篩選出符合實驗條件的菌株和確定了培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上[6],本文采用響應(yīng)面法[7-8]對其發(fā)酵培養(yǎng)基進一步優(yōu)化,以期進一步提高水蘇糖純度。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

乳酸菌:保加利亞乳桿菌 (Lb.bulgaricus)、嗜熱鏈球菌 (Str.ther m ophilus)(活菌數(shù) >109個 /g),實驗室自配菌粉;日本曲霉 (Aspergillus japonicas):購自CICC。

1.1.2 培養(yǎng)基

日本曲霉種子培養(yǎng)基,PDA培養(yǎng)基;初始發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L):酵母浸膏 10;酪蛋白胨 5;硝酸鈉 5;K2HPO4 2;MgSO4·7H2O 0.2;CaCO32,溶于草石蠶浸提液 1 000 mL,pH自然。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的優(yōu)化設(shè)計

1.2.1.1 Plackett-Burman設(shè)計

通過單因素試驗發(fā)現(xiàn),影響水蘇糖純度的主要因素有:酵母浸膏、酪蛋白胨、硝酸鈉、K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCO3。用 Plackett-Bur man設(shè)計對以上 6個因素進行全面考察,選用 N=12的 P-B設(shè)計,如表 1和表 2所示,X7～X10為 4個空項設(shè)計,用來估計實驗誤差。試驗結(jié)果用Minitab軟件進行數(shù)據(jù)分析。

表1 Plackett-Burman試驗水平

表2 Plackett-Burman試驗設(shè)計

1.2.1.2 最陡爬坡試驗接近最大響應(yīng)面區(qū)域

根據(jù) P-B試驗分析的結(jié)果篩選出影響水蘇糖純度的顯著因素,并以各顯著因素的正負效應(yīng)確定下一步試驗的最陡爬坡路徑 (包括變化方向和變化步長),快速的逼近最佳區(qū)域。試驗設(shè)計見表 3。

表3 最陡爬坡試驗設(shè)計 g/L-1

1.2.1.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計

通過 P-B試驗確定出影響水蘇糖純度的主要因素,進而由最陡爬坡實驗確定接近響應(yīng)值區(qū)域顯著因素的濃度,利用 Box-Bohnken設(shè)計進一步優(yōu)化,其設(shè)計見表 4和表 5。每個因素有 3個水平,在中心點上有 3個重復(fù),以水蘇糖純度為響應(yīng)值 Y,試驗數(shù)據(jù)用Minatab軟件進行多項式回歸分析,通過回歸擬合后得到一個試驗因子對響應(yīng)值影響的二階經(jīng)驗?zāi)Ｐ?/p>

式中:Y為預(yù)測響應(yīng)值即水蘇糖純度,β為回歸系數(shù),xi為自變量的編碼水平,它與自變量 Xi之間的關(guān)系是:xi=(Xi-Xi0)/ΔXi其中,Xi0為實驗中心點處的自變量值,ΔXi為自變量的變化步長。

表4 Box-Behnke試驗因素水平

表5 Box-Behnke試驗設(shè)計

1.2.2 培養(yǎng)條件

草石蠶浸提液濃度為 9°Brix,每升培養(yǎng)基中添加孢子濃度為 2×108個 /mL的日本曲霉菌懸液 20 mL和 2 g乳酸菌干粉,放入 28℃恒溫箱中靜置培養(yǎng) 48 h后,轉(zhuǎn)移至 37℃恒溫箱靜置培養(yǎng) 24 h。

1.2.3 水蘇糖純度的測定

發(fā)酵結(jié)束后,取 50 mL糖液,加 0.1 g活性炭對糖液進行脫色,加熱保持至 80℃左右攪拌 30 min,趁熱過濾,濾液稀釋至折光為 2.0后,經(jīng) 0.22μm的微孔濾膜過濾得到待分析糖液,然后用 HPLC法對糖液進行檢測。HPLC的色譜條件為:示差檢測器:島津公司 LC10-AT;流動相真空抽濾脫氣裝置及0.22μm微孔膜;色譜柱:氨基鍵合柱:Hypersil-NH2(大連依利特公司);填料粒徑:5μm;柱尺寸:Φ4.6 mm ×250 mm(大連依利特公司);柱溫:30℃;微量進樣器:25μL;流動相 ∶V(乙腈 ) ∶V(水 )=70∶30;進樣量為10μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman設(shè)計篩選影響水蘇糖純度的主要因素

根據(jù)單因素試驗選取對水蘇糖純度有影響的 6個因素,每個因素選高低 2個水平,以水蘇糖純度為響應(yīng)值 (Y),X7～X10為 4個空項設(shè)計,用來估計試驗誤差。試驗設(shè)計及結(jié)果如表 6(每組試驗有 3個重復(fù),以平均值為準(zhǔn))所示。分別計算個因素效應(yīng),并進行重要性評價,結(jié)果見表 7。

由表 7可知,發(fā)酵液培養(yǎng)基組分中對最終水蘇糖純度有顯著影響 (可信度 >95%)的因素包括酵母膏,酪蛋白胨及硝酸鈉。其中,酵母膏和酪蛋白胨有顯著正效應(yīng),硝酸鈉有顯著負效應(yīng)。因此,后面的試驗主要考察這 3個因素,且應(yīng)適當(dāng)增加酪蛋白胨和酵母膏的含量,減少硝酸鈉的含量。

2.2 最陡爬坡試驗接近最大響應(yīng)面區(qū)域

從表 7可知,在影響水蘇糖純度的各主要培養(yǎng)基組分中,酵母膏和酪蛋白胨有顯著正效應(yīng),硝酸鈉有顯著負效應(yīng)。根據(jù)這 3個因素效應(yīng)大小的比例設(shè)定它們的變化方向和步長,其他各因素分別取各自的低水平進行試驗,試驗設(shè)計及結(jié)果見表 8。

表8可知,隨著 3個重要因素的不同變化,糖液中水蘇糖純度的變化趨勢是先上升后下降,其中第四組培養(yǎng)基組分對應(yīng)的水蘇糖純度最高,響應(yīng)變量接近最大響應(yīng)區(qū)域,所以以第四組條件為中心點進行響應(yīng)面分析。

表6 Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果

表7 Plackett-Burman試驗水平及其主效應(yīng)分析

表8最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果

2.3 Box-Behnke試驗設(shè)計篩選重要因素的最優(yōu)水平

以酵母膏,酪蛋白胨及硝酸鈉 3個重要因素為自變量,各因素編碼水平如表 4所示。Box-Behnke試驗設(shè)計及試驗結(jié)果如表 9所示。

表9 Box-Behnke試驗設(shè)計及結(jié)果

以水蘇糖純度為響應(yīng)值,利用Minitab軟件對表9的結(jié)果進行回歸擬和,得到二階回歸方程為:Y=90.700 0+0.42X1+1.237 59X2+0.237 5X3-0.55X2-1.325X2- 1.325X2+ 0.425XX-123120.075X1X3-0.85X2X3此數(shù)學(xué)模型的方差分析結(jié)果如表 1 0所示,相關(guān)系數(shù)達到 0.94,說明模型對實際情況的擬和較好。因此可用回歸方程對最佳培養(yǎng)基組分進行預(yù)測。

表10 回歸方程的方差分析

2.4 響應(yīng)面分析及最佳培養(yǎng)成分確定

利用Minitab軟件對回歸模型進行響應(yīng)面分析,得到各響應(yīng)面立體分析圖及等值線圖,見圖 1～圖 6。

由圖 1和圖 2可以看出,水蘇糖純度隨著酵母膏含量的增加其變化趨勢在酪蛋白胨濃度為 5～8 g/L時不明顯,在酪蛋白胨濃度為 8～9 g/L時隨酵母膏含量增加而增加。在酵母膏含量不變的情況下,水蘇糖純度隨著酪蛋白胨含量的增加先增加后減少,且增加速度快而減少速度較慢。

圖 2 Y=f(X1,X2)的等高線圖

圖 3 Y=f(X1,X3)的響應(yīng)面圖

圖 4 Y=f(X1,X3)的等高線圖

由圖 3和圖 4可以看出,在硝酸鈉含量不變的情況下,水蘇糖純度隨著酵母膏濃度的增加變化趨勢不明顯,在低酵母膏濃度范圍內(nèi) (9～11.25 g/L)隨著酵母膏的增加有增高變化,高酵母膏濃度范圍內(nèi)幾乎沒有變化。在酵母膏含量不變的情況下,水蘇糖純度隨著硝酸鈉濃度的增加先增加后減少,且增加速度快而減少速度較慢。

由圖 5和圖 6可以看出,在硝酸鈉濃度為 3～7 g/L內(nèi),水蘇糖純度隨著酪蛋白胨濃度增加而增加。在酪蛋白胨濃度含量不變的情況下,水蘇糖純度隨著硝酸鈉濃度的增加先增加后減少,酪蛋白胨濃度越高變化趨勢越不明顯。

綜合分析圖 1～圖 6,酵母膏、酪蛋白胨和硝酸鈉均對發(fā)酵液中水蘇糖純度有顯著的影響,其中酪蛋白胨的作用最為顯著。三者之間均存在交互影響作用,與方差分析結(jié)果一致。

由圖及軟件分析可知,回歸方程存在穩(wěn)定點。通過響應(yīng)優(yōu)化器分析知 Y的最大值出現(xiàn)在 X1、X2、X3的編碼值分別為 (0.6162,0.5960,-0.1111),即酵母膏、酪蛋白胨和硝酸鈉的最佳濃度分別為 (g/L):13.8、8.2、4.8,此時 Y達到最大值為 91.2。以此濃度配置發(fā)酵培養(yǎng)基,分批次發(fā)酵進行試驗驗證,得到水蘇糖純度均值為 91.0,這與預(yù)測值是基本吻合的。

圖 5 Y=f(X2,X3)的響應(yīng)面圖

圖 6 Y=f(X2,X3)的等高線圖

3 結(jié)論

本文通過 Plackett-Burman設(shè)計和 Box-Behnke試驗及響應(yīng)面分析,確定了發(fā)酵液所用培養(yǎng)基的濃度,酵母膏、酪蛋白胨、硝酸鈉、K2HPO4、碳酸鈣、MgSO4·7H2O的最佳濃度分別為 (g/L):13.8、8.2、4.8、1、1、0.1。綜合以上工藝參數(shù)對草石蠶浸提液進行發(fā)酵,得到的糖液中水蘇糖純度可達到 91%、單雙糖含量在 3%左右,水蘇糖保留率大于 95%。在此優(yōu)化培養(yǎng)基下,比優(yōu)化前純度提高了 6%。

[1] 鄭建仙,功能性低聚糖,北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2004.

[2] Pan B,Li d,et al.Effect of dietary supplementation with alpha-galactosidase preparation and stachyose on growth performance,nutrient degestibility and intestinal bacterial populations of piglets[J].Arch Tierernahr,2002,56(5):327-337.

[3] 郭美麗,周燕平等,“凈常樂牌水蘇糖沖劑”對實驗小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的研究[J].中國自然醫(yī)學(xué)雜志,2004,6(2):77-80.

[4] 程書權(quán),孔淑敏,中草藥活性成分治療慢性肝病的現(xiàn)代研究[J].國外醫(yī)學(xué)中醫(yī)中藥分冊,2004,26(4):211.

[5] 任宏強,水蘇糖[J].精細與專用化學(xué)品,2002,14:15-17.

[6] 王雪,張金澤,水蘇糖發(fā)酵提純菌株的篩選研究[J].食品發(fā)酵與工業(yè),2010,(10):94-97.

[7] Dale B McDonald,Walter J Grantham,WayneL Tabor,et al.Global and localoptimization using radial basis function response surface models[J].Applide MsthematicalModelling,2007,31:2 095-2 110.

[8] Montgomery D C.Design and Analysis of Experiments(3rd ed)[M].New York:JohnW iley&Sons,1991.

M edium Optim ization by Response Surface M ethodology for Purification of Stachyose by Fermentation

ZhangMin,Zhang Jin-ze,Duan Su-fang,Gao Jia-tao,Wang Xue
(Institution of China National Research Institute of Food&Fe rmentation Industries,Beijing 100027,China)

By using Plackett-Burman and response surface methodology,we studied the medium opti mization of purification of stachyose by fer mentation.A Plackett-Burman design was first used to evaluate the influence of six related factors,and yeast extract,casein peptone,NaNO3were affir med the important factors in the medium,and then the path of steepest ascent and the Box-Behnken design were used for further optimization on these three factors.By solving the quardratic regression model equation,the optimal concentrationsof the variableswere determined as:yeast extract1.38%,casein peptone 0.82%,NaNO30.48%.Under the optimal culture condition,the purity of the stachyose increased from 85%to 91%.

response surface methodology,fermentation,purification,stachyose

碩士研究生 (張金澤教授級高級工程師為通訊作者)。

＊國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(2007AA10Z335)

2010-02-11,改回日期:2011-02-12