中介素1-53對肺缺血再灌注損傷大鼠NF-κB和CINC-1的影響

趙 卉 劉 妮 楊淑娟 李建強(qiáng)

中介素1-53對肺缺血再灌注損傷大鼠NF-κB和CINC-1的影響

趙 卉 劉 妮 楊淑娟 李建強(qiáng)＊

（山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院呼吸內(nèi)科，太原030001）

目的 探討中介素1-53對大鼠肺缺血再灌注損傷后核因子-κB（NF-κBp65）和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化物（CINC-1）蛋白表達(dá)的影響。方法 將健康Wistar大鼠54只隨機(jī)分為手術(shù)對照組（C組）、缺血再灌注組（IR組）、中介素干預(yù)組（D組）。每組分別在缺血45min，再灌注60min、120min 3個(gè)時(shí)點(diǎn)處死6只大鼠，觀察肺組織病理形態(tài)變化，測定肺組織濕干質(zhì)量比值（W／D）、髓過氧化物酶（MPO）活性，肺組織勻漿CINC-1蛋白含量及NF-κBp65蛋白的表達(dá)。結(jié)果 IR組的W／D值、MPO活性、NF-κBp65和CINC-1的蛋白表達(dá)均高于C組，中介素1-53干預(yù)后各值較IR組有所下降；D組肺組織病理學(xué)變化較IR組明顯減輕。結(jié)論 中介素1-53的應(yīng)用可以減輕肺缺血再灌注損傷，作用機(jī)制可能與其抑制NF-κB的活化，降低肺組織CINC的表達(dá)，從而減少肺內(nèi)PMN的浸潤密切相關(guān)。

肺；缺血再灌注損傷；中介素1-53；NF-κBp65；中性粒細(xì)胞趨化因子-1

近年來，肺缺血再灌注損傷（LIRI）一直是影響肺栓塞溶栓治療、心肺搭橋術(shù)及各種體外循環(huán)術(shù)預(yù)后的一個(gè)重要因素，因此，尋找治療LIRI的藥物勢在必行。中介素（IMD）是一種新的降鈣素（CT）／降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）家族肽，它的一個(gè)重要肽段IMD1-53，目前報(bào)道其有抑制炎癥細(xì)胞浸潤，減少自由基的生成，擴(kuò)張血管等生物學(xué)效應(yīng)［1-3］，但中介素1-53對肺缺血再灌注損傷的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過建立大鼠在體肺缺血再灌注模型，在缺血再灌注前給予IMD1-53，來探討外源性人工合成的IMD1-53對肺缺血再灌注損傷的作用及其可能機(jī)制。

材料和方法

1.材料

健康雄性Wistar大鼠54只（山西醫(yī)科大學(xué)動物中心提供），體重220-300g。合成的大鼠中介素1-53（IMD1-53）（美國 Phoenix pharmaceutical公司），NF-κBp65多克隆抗體、DAB顯色試劑盒（福州邁新生物有限公司），CINC-1ELISA試劑盒（美國R＆D進(jìn)口分裝公司），髓過氧化物酶（MPO）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

2.方法

2.1 動物模型的建立：健康 Wistar大鼠，3%戊巴比妥鈉50mg／kg腹腔注射麻醉后，尾靜脈注射肝素（100U／kg）。仰臥位固定，氣管切開后插管，接動物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣，經(jīng)胸骨右緣第3-5肋間開胸，游離右肺門，下穿手術(shù)線，靜息5min后，于呼氣末結(jié)扎右肺門（右主支氣管，右肺動、靜脈），缺血45min后開放，使肺充盈再灌注120min，制成在體肺IR模型。

2.2 實(shí)驗(yàn)動物與分組：大鼠54只隨機(jī)分為3組，每組18只。正常對照組（C組）：開胸游離右肺門后，不行夾閉阻斷。缺血再灌注組（IR組）：開胸游離右肺門后，夾閉阻斷45min，繼行再灌注120min。中介素干預(yù)組（D組）：于缺血再灌注前一小時(shí)將2nmol／kg的中介素1-53溶于1ml生理鹽水腹腔注入。各組分別于缺血45min，再灌注60min、120min 3個(gè)時(shí)點(diǎn)采集標(biāo)本。

2.3 病理檢查：取右肺中葉約1cm×1cm×1cm大小組織塊，用10%甲醛固定，予以常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

2.4 免疫組化法測肺組織NF-κBp65：采用免疫組織化學(xué)染色（SP）法檢測大鼠肺組織NF-κBp65蛋白的表達(dá)。染色陽性結(jié)果為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，以平均光密度值（IOD）表示。

2.5 肺組織勻漿CINC-1含量：冷凍肺組織稱重后，使用PBS（pH＝7.4）緩沖液制成10%勻漿，離心，留取上清液，按照ELISA試劑盒說明書測定CINC-1含量。

2.6 肺組織W／D比值測定：取1g右肺中葉組織用分析天平稱重為濕質(zhì)量，置于70℃電熱恒溫干燥箱中烤48h后稱重為干質(zhì)量，濕質(zhì)量與干質(zhì)量之比即為W／D。

2.7 肺組織MPO測定：取右肺上葉相同部位肺組織1g，制成勻漿，將制備好的勻漿以3500r／min離心15min取上清液用比色法測MPO。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS16.0專用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.病理組織學(xué)改變

光鏡下可見正常肺組織肺泡壁薄，無明顯充血水腫（圖1）；IR組肺組織肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡隔增寬且肺泡間隔有炎性細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)有滲出液、紅細(xì)胞及滲出的炎性細(xì)胞，且IR組肺組織損傷隨再灌注時(shí)間延長而加重（圖2）；D組炎性浸潤及肺泡腔內(nèi)出血、滲出較IR組明顯減輕（圖3）。

2.肺組織免疫組化 NF-кBp65

NF-кBp65陽性表達(dá)在支氣管上皮細(xì)胞，主要位于細(xì)胞核內(nèi)。C組NF-кBp65表達(dá)呈陰性或極弱陽性（圖4）；IR組缺血后表達(dá)顯著升高，并隨再灌注時(shí)間的延長進(jìn)行性增高，與C組比較（P均＜0.01）；IMD1-53.干預(yù)后 NF-кBp65表達(dá)下降有顯著意義（P＜0.05）（圖5，6）。

3.肺組織勻漿CINC-1含量

與正常對照組比較，IR組各時(shí)相點(diǎn)CINC-1含量明顯增加（P＜0.05），經(jīng)IMD1-53干預(yù)后CINC-1含量明顯下降（P＜0.05）（表1）。

4.肺組織MPO活性的測定

IR組和D組隨再灌注時(shí)間的延長，MPO活性逐漸升高，且較C組也明顯升高（P＜0.05）；但D組肺組織MPO活性要低于IR組（P＜0.05）（表1）。

5.肺組織 W／D

經(jīng)缺血后，C組與IR組兩組大鼠肺組織 W／D比值變化不顯著；再灌注后，IR組肺組織W／D比值呈進(jìn)行性升高（再灌注60min、120min vs缺血45min，P＜0.05）；D組IMD1-53干預(yù)后肺組織 W／D比值較IR組明顯降低（再灌注60min、120min時(shí)，D組vs IR組，P＜0.05）（表1），但仍高于C組。

表1 各組缺血／再灌注不同時(shí)點(diǎn)CINC-1含量、MPO活性、W／D比值、NF-кBp65蛋白比較（xˉ±s）Table 1 The comparison of the contents of CINC-1，the activity of MPO，the lung W／D and the protein expression of NF-кBp65

討 論

LIRI的主要病理改變是肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，肺血管的通透性增加，繼而肺血管阻力增加、壓力升高，引起肺水腫及氣體交換功能受損。其發(fā)生機(jī)制包括五個(gè)方面［4］：①氧自由基及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)；②細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)；③PMN（中性粒細(xì)胞）大量浸潤引起的過度的炎癥反應(yīng)；④參與PIRI體液因子的作用；⑤細(xì)胞凋亡與肺缺血再灌注損傷。

肺組織W／D比值是常用的評價(jià)肺水含量及反映肺微血管損傷的指標(biāo)，他的增高反映了肺微血管通透性的增加。本實(shí)驗(yàn)中IR組W／D進(jìn)行性升高，使用IMD1-53干預(yù)的D組肺組織 W／D值明顯降低，且病理切片顯示D組的肺組織與IR組相比病理學(xué)改變明顯減輕。表明IMD1-53干預(yù)可以減輕缺血再灌注引起的肺組織損傷。

中性粒細(xì)胞（PMN）的肺內(nèi)聚集和激活在肺缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［5］。目前認(rèn)為中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的肺缺血再灌注損傷主要包括2個(gè)步驟［6］：①中性粒細(xì)胞被激活并在趨化因子的作用下在肺內(nèi)聚集。②聚集的中性粒細(xì)胞通過呼吸爆發(fā)和脫顆粒作用釋放大量氧自由基、蛋白水解酶，損傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞，引起肺損傷。MPO作為PMN的特異性酶，其含量的高低反映PMN的浸潤程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，D組MPO活性較IR組明顯減低。提示給予IMD1-53干預(yù)可減輕LIRI時(shí)PMN的聚集。而大鼠中性粒細(xì)胞趨化因子-1（CINC-1），在結(jié)構(gòu)和功能上對應(yīng)于人類的IL-8家族成員，對大鼠PMN具有很強(qiáng)的趨化和激活作用［7］。本實(shí)驗(yàn)顯示IR組各時(shí)相大鼠CINC-1濃度顯著升高，此效應(yīng)可以被IMD1-53抑制。這表明IMD1-53的干預(yù)可減輕缺血再灌注損傷肺組織中PMN的聚集浸潤，這可能與抑制CINC-1的產(chǎn)生有密切的關(guān)系。

NF-κB是一種廣泛存在于多細(xì)胞具有多向性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白因子。NF-κB的激活受多種因素的影響，腫瘤壞死因子（TNF-α）、氧自由基等是其強(qiáng)激活劑［8］。NF-κB一旦被激活，經(jīng)過復(fù)雜的信息傳遞過程，迅速誘導(dǎo)多種細(xì)胞活化基因的轉(zhuǎn)錄，翻譯。NF-κB可高效誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子（如：TNF-α，IL-6，IL-8，TNF-β，G-CSF等），黏附分子（ICAM-1，E-selection等），趨化因子（C3，COX-2等）的基因表達(dá)［9-11］。NF-κB調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是 LIRI炎癥反應(yīng)的主要炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，因而，影響NF-κB則可在轉(zhuǎn)錄水平影響多種炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，從而對組織的再灌注損傷產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IR組NF-κB的表達(dá)比C組明顯增高，而缺血前給予IMD1-53干預(yù)，則NF-κB的表達(dá)較IR組有顯著的降低。這提示IMD1-53可抑制肺組織NF-κB，從而抑制多種炎癥介質(zhì)的過度表達(dá)，減輕再灌注損傷肺組織中PMN的聚集浸潤。但是IMD1-53是通過何種途徑或機(jī)制影響再灌注損傷肺組織中NF-κB的表達(dá)，需進(jìn)一步的研究。

綜上所述，IMD1-53對缺血再灌注引起的肺組織損傷有一定的保護(hù)作用，可能的作用機(jī)制與其抑制NF-κB的表達(dá)，降低肺組織CINC-1的濃度，減少肺內(nèi)PMN的浸潤密切相關(guān)。

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圖 版 說 明

圖1 C組肺組織。HE×200

圖2 IR組再灌注120nin肺組織。HE×200

圖3 D組再灌注120min肺組織。HE×200

圖4 C組可見NF-кBp65表達(dá)呈陰性或極弱陽性。SP法×200

圖5 IR組再灌120min可見NF-кBp65較正常組表達(dá)明顯增多。SP法 ×200

圖6 D組再灌注120min可見NF-кBp65較IR組表達(dá)較弱，但仍高于正常組。SP法 ×200

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Lung tissue in the C group.HE staining.×200

Fig.2 Lung tissue of 120min reperfusion in the IR group.HE staining.×200

Fig.3 Lung tissue of 120min reperfusion in the D group.HE staining.×200

Fig.4 Expression of NF-кBp65in the C group.SP method×200

Fig.5 Expression of NF-кBp65in the IR group.SP method×200

Fig.6 Expression of NF-кBp65in the D group.SP method×200

Effects of intermedin 1-53 on nuclear factor-κB and cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1 in lung ischemia-reperfusion injury of rats

Zhao Hui，Liu Ni，Yang Shujuan，Li Jianqiang＊
＊ （Department of Respiratory Medicine，The Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University，
Taiyuan030001，China）

Objective To investigate the effects of IMD1-53on the protein expression of nuclear Factor-κB （NF-κBp65）and cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1（CINC-1）in lung ischemia-reperfusion injury of rats.Methods Fifty-four healthy Wistar rats were randomly divided into 3groups：surgical controls（C group），ischemia-reperfusion group（IR group）and intermedin-pretreated group（D group）.At each of 3 time spots（when rats were subjected to 45min of ischemia，then 60min and 120min of reperfusion），6rats from each group were killed to collect plasma sample and the whole right lung.After observing histopathological changes，we examined the wet／dry weight ratio W／D，MPO activity，CINC-1levels and NF-κBp65 protein expression of the lung tissue.Results The lung W／D，MPO activity，protein expression of CINC-1 and NF-κB p65in IR increased progressively and were evidently higher than those of C group（P＜0.05）.However compared with the IR group，preadministration of IMD1-53inhibited the increase of the indexes mentioned above.Pathological examination showed that the IR induced injury was also ameliorated by IMD1-53pretreament.Conclusion Inhalation of IMD1-53could protect against ischemia-reperfusion induced lung injury in rats by inhibiting the infiltration of PMN in the lung possibly through inhibiting the activation of lung NF-κB and the attenuating expression of CINC-1during lung ischemia-reperfusion in rats.

Lung；Ischemia-reperfusion injury；Intermedin1-53；Nuclear Factor-κBp65；Cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1

R322.35R392

A

10.3870／zgzzhx.2011.06.009

2011-05-09

2011-10-01

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20090311059-2）

趙卉，女（1970年），漢族，副主任醫(yī)師。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）