• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    p16和Ki67在非小細胞肺癌組織中的表達及其與預(yù)后的關(guān)系

    2011-12-15 07:18:18武世伍承澤農(nóng)宋文慶陶儀聲
    關(guān)鍵詞:分化陰性淋巴結(jié)

    武世伍 承澤農(nóng) 俞 嵐 宋文慶 陶儀聲

    p16和Ki67在非小細胞肺癌組織中的表達及其與預(yù)后的關(guān)系

    武世伍 承澤農(nóng) 俞 嵐 宋文慶 陶儀聲*

    (蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科;蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室 安徽233003)

    目的 探討p16和 Ki67在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表達,研究它們對 NSCLC患者預(yù)后的影響及其與臨床及病理因素之間的關(guān)系。方法 收集NSCLC術(shù)后標(biāo)本160例及正常肺組織20例(對照組),應(yīng)用免疫組化法檢測NSCLC組織和正常肺組織中p16和Ki67的表達。結(jié)果 在NSCLC組織和正常肺組織中,p16和Ki67的陽性表達率分別為23.8%、82.5%和90%、5%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。多因素分析:PTNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、p16及Ki67的表達是影響NSCLC根治術(shù)后患者預(yù)后的獨立因素(P<0.05);p16陽性組與陰性組5年生存率分別為55.3%和18.0%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);Ki67陽性組與陰性組5年生存率分別為23.5%和42.9%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),p16和Ki67表達呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 p16和Ki67參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展,p16和Ki67的表達水平與NSCLC的發(fā)展及預(yù)后有一定的關(guān)系。

    非小細胞肺癌;p16;Ki67;預(yù)后

    原發(fā)性肺癌無論其發(fā)病率和死亡率均增長很快,逐漸成為人類頭號殺手[1-3],其中約85%為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer NSCLC)[4]。p16基因是1994年被克隆的一個基因,又稱為多腫瘤抑制基因1(multiple tumor suppressor MTS1),后被人類基因組織正式命名為CDKN2(cyclin dependent kinase inhibitor 2)。研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞系中p16基因缺失率達80%以上,在實體瘤中可達70%左右,其編碼的產(chǎn)物p16蛋白既是細胞周期有效調(diào)控者,又是抑制腫瘤細胞生長的關(guān)鍵因子。Ki67是一種與細胞增殖相關(guān)的核抗原,與腫瘤的增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移潛能和預(yù)后密切相關(guān)。本研究通過檢測160例NSCLC病例標(biāo)本p16和Ki67的表達,探討p16和Ki67與NSCLC患者的預(yù)后關(guān)系及其與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤局部浸潤等因素的關(guān)系。

    材料和方法

    1.一般資料

    收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科2003年1月-2005年4月存檔石蠟包埋NSCLC組織標(biāo)本160例(術(shù)前未行放、化療)和正常肺組織標(biāo)本20例,所有病例均有完整的臨床、病理及隨訪資料,入選病例隨訪至患者死亡或截止2010年4月,隨訪時間為3-84個月。其中男性130例,女性30例;從大體類型看,中央型120例,周圍型40例;鱗癌116例(高分化17例,中分化71例,低分化28例),腺癌44例(高分化4例,中分化32例,低分化8例)。年齡26-82歲,中位年齡59.6±9.5歲,≥60歲86例,<60歲74例;腫瘤長徑 D≥3.0cm 145例,D<3.0cm 15例;按淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移,有轉(zhuǎn)移76例,無轉(zhuǎn)移84例。根據(jù)UICC2002版PTNM病理分期標(biāo)準(zhǔn)進行分期,其中Ⅰ期患者31例,Ⅱ期患者43例,Ⅲ期患者34例,Ⅳ期患者52例。

    對照組正常肺組織20例取自肺癌腫塊旁>5.0cm的肺組織,病理HE染色證實為正常肺組織。

    2.試劑

    鼠抗人p16/MTS1單克隆抗體(產(chǎn)品編號:MAB-0223,克隆號:J8),鼠抗人 Ki67antigen單克隆抗體(產(chǎn)品編號:MAB-0129,克隆號:MIB-1)。ElivisionTM plus試劑盒以及DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

    3.實驗方法

    采用免疫組織化學(xué)ElivisionTM plus法,將石蠟標(biāo)本以4μm厚連續(xù)切片,烤干,于二甲苯溶液及不同濃度的乙醇中脫蠟至水洗。免疫組化染色操作步驟按試劑盒說明書進行。采用已知陽性片作對照,以PBS液代替一抗作空白對照。

    4.結(jié)果判定

    p16在NSCLC組織中主要定位于細胞核和細胞漿,Ki67蛋白在NSCLC組織細胞中表達主要定位于細胞核,為黃色或棕黃色顆粒。采取二次計分法:每例標(biāo)本隨機計數(shù)5個高倍視野(×400),計數(shù)每個高倍視野中陽性細胞所占百分比并計分。按染色強度計分:0分為無色,1分為淡黃色,2分為棕黃色,3分為棕褐色。再將陽性細胞百分比計分,0分為陰性,1分為陽性細胞<10%,2分為11%-50%,3分為51%-75%,4分為>75%。用染色強度得分和細胞數(shù)得分的乘積作為判斷標(biāo)準(zhǔn),若積分≤1為陰性,>1為陽性。免疫組化結(jié)果由兩位病理醫(yī)師采用雙盲法讀片評定。

    5.統(tǒng)計分析

    采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。p16和Ki67表達陽性組與陰性組生存分析用Kaplan-Meier法,組間比較用log-rank檢驗,多因素分析采用Cox回歸多因素模型,p16和Ki67在NSCLC組織中表達與正常肺組織、各臨床及病理因素的相關(guān)性采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1.p16和Ki67在NSCLC中的表達

    p16在NSCLC組織中主要定位于細胞核和細胞漿,Ki67蛋白在NSCLC組織細胞中表達主要定位于細胞核,為黃色或棕黃色顆粒,表達率分別為23.8%(38/160)和82.5%(132/160)(圖1),正常肺上皮組織中的表達率分別為90%(18/20)和(1/20)5%。p16和Ki67在NSCLC組與對照組間均有顯著性差異(P<0.05)。另外,Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)p16的表達與Ki67的表達呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.001)(表1)。

    2.多因素分析

    將病理組織分化(分為低分化組、中分化組與高分化組)、年齡(分為≥60歲組與<60歲組)、PTNM分期(分為ⅠⅡ期組與Ⅲ Ⅳ期組)、腫瘤直徑(分為≥3.0cm組與<3.0cm組)、腫瘤位置(分為中央型組與周圍型組)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(分為有轉(zhuǎn)移組與無轉(zhuǎn)移組)、性別(男性組與女性組)、p16(分為表達陽性組與陰性組)和Ki67(分為表達陽性組與陰性組)等因素引入Cox模型進行多因素分析,結(jié)果顯示:p16和Ki67的表達、PTNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響NSCLC患者預(yù)后的獨立因素(表2)。

    3.生存分析

    本組病例總的5年生存率為26.9%。Kaplan-Meier生存分析顯示p16陽性組與陰性組5年生存率分別為55.3%和18.0%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001);Ki67陽性組與陰性組5年生存率分別為23.5%和42.9%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001,圖2、圖3)。

    圖1 p16及Ki67在NSCLC組織中的表達A:NSCLC中p16表達陽性,主要表達于細胞核(A為低分化鱗癌ElivisionTM×400);B:NSCLC中Ki67表達陽性,主要表達與細胞核(B為中分化鱗癌,ElivisionTM×400)。Fig.1 Expression of p16and Ki67in NSCLC (ElivisionTM×400)A:positive staining of p16in the nuclei of NSCLC(A is poor grading squamous carcinoma);B:positive staining of Ki67in the nuclei of NSCLC (B is mediate grading squamous carcinoma).

    圖2 p16表達陽性組與陰性組NSCLC患者生存曲線Fig.2 Survival curves of NSCLC patients with positive or negative p16expression圖3 Ki67表達陽性組與陰性組NSCLC患者生存曲線Fig.3 Survival curves of NSCLC patients with positive or negative Ki67expression

    圖2 p16表達陽性組與陰性組NSCLC患者生存曲線Fig.2 Survival curves of NSCLC patients with positive or negative p16expression圖3 Ki67表達陽性組與陰性組NSCLC患者生存曲線Fig.3 Survival curves of NSCLC patients with positive or negative Ki67expression

    4.p16和Ki67表達與各臨床病理因素的關(guān)系p16的表達與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及PTNM分期等有關(guān)(P<0.05),即p16表達越高,腫瘤的分化好、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移少以及PTNM分期早;而Ki67的表達與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及PTNM分期等有關(guān)(P<0.05),即Ki67的表達越高,分化越差、越易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期越晚(見表3)。

    表1 p16、Ki67在NSCLC和正常肺組織中的表達Table 1 Expression of p16and Ki67in NSCLC and Normal lung tissue

    表2 160例NSCLC患者多因素分析Table 2 Multivariate survival analysis of 160patients with non-small cell lung cancer

    表3 160例NSCLC組織p16和Ki67的表達與臨床、病理因素的關(guān)系Table 3 Correlation of p16and Ki67expression to clinicopathologic characteristics of 160patients with NSCLC

    討 論

    p16/MTS1基因定位于人類染色體9p21位置,全長8.5kb,編碼一種細胞周期素依賴性激酶(CDK4)的抑制蛋白,即p16。p16既是細胞周期有效調(diào)控者,又是抑制腫瘤細胞生長的關(guān)鍵因子。p16與cyclinD競爭與CDK4結(jié)合,從而阻止細胞由G1期進入S期,抑制細胞增殖,阻止細胞生長,對細胞生長起負(fù)調(diào)控作用。研究顯示,作為一種重要的抑癌基因,其失活與多種惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān),如黑色素瘤、肝癌、肺癌、食管癌、胰腺癌等腫瘤中都檢測到p16基因的失活,提示p16基因異常是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的一個重要事件。導(dǎo)致p16基因失活的原因有:(1)基因缺失;(2)基因突變;(3)甲基化。當(dāng)p16基因異常而不能正常表達時,cyclinD則與CDK4優(yōu)勢結(jié)合,細胞生長失去控制,使細胞獲得無限增殖的能力。本研究發(fā)現(xiàn),NSCLC組織中p16的表達顯著低于癌旁正常肺組織,表明肺癌組織中存在p16蛋白的缺失,這與張軍航等[5]的研究結(jié)果一致,提示肺癌的發(fā)生可能與p16基因表達產(chǎn)物異常有關(guān)。進一步的研究還發(fā)現(xiàn),p16蛋白在肺癌組織中表達水平與細胞分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。細胞分化越差,p16的表達越低;臨床分期越高,p16的表達越低;發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例p16蛋白陽性表達率(13.2%)明顯低于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例(33.3%)。此結(jié)果表明隨著肺癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移以及向晚期發(fā)展,p16的表達率越來越低,提示p16基因異常是腫瘤發(fā)生與發(fā)展過程中的一個重要事件[6]。同時還發(fā)現(xiàn)p16基因蛋白表達與NSCLC的組織類型、腫瘤大小、位置、發(fā)病年齡及性別等無關(guān)。

    Ki67是與細胞增殖相關(guān)的核抗原,僅分布于核內(nèi),位于10號染色體上。其表達出現(xiàn)于G1中期到晚期,S期和G2期逐漸增加,有絲分裂期達高峰,然后在有絲分裂期后迅速下降[7]。Ki67蛋白的表達水平可反映腫瘤細胞的增殖活性,僅在增殖細胞中表達。Ki67高表達是細胞增殖活躍的重要標(biāo)志,因此與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)[8-9]。本研究顯示Ki67在NSCLC中的表達率顯著高于正常肺組織,說明NSCLC的形成與細胞的異常增殖有關(guān),且Ki67的表達率隨著NSCLC臨床分期的增加以及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移而顯著增高,Ki67表達水平高者易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,說明Ki67與NSCLC的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。研究結(jié)果還顯示Ki67的表達與患者的年齡、腫瘤大小、組織學(xué)類型等無關(guān)。本研究多因素分析顯示p16和Ki67的表達情況、PTNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況是影響NSCLC獨立預(yù)后因素。進一步的生存分析顯示p16陽性組與陰性組的5年生存率分別為55.3%和18.0%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,提示p16蛋白表達陽性的NSCLC患者術(shù)后生存時間比較長,比p16表達陰性者預(yù)后好,這與其它學(xué)者[10-11]的研究結(jié)果相一致,因此檢測p16蛋白的表達可作為判斷NSCLC預(yù)后的指標(biāo)。Ki67陽性組與陰性組的5年生存率分別為23.5%和42.9%,差異具有顯著性,即Ki67陽性表達組生存時間低于陰性表達組,這與文獻報道結(jié)果相同[12]。

    本研究對NSCLC中p16蛋白、Ki67抗原的表達進行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)癌組織中隨著Ki67陽性表達率的升高,p16表達率顯著降低,兩者呈負(fù)相關(guān)。提示p16蛋白的表達與癌細胞增殖指數(shù)可能存在一定聯(lián)系,當(dāng)細胞內(nèi)p16蛋白表達降低時,cyclinD則與CDK4優(yōu)勢結(jié)合,刺激細胞旺盛分裂,細胞獲得無限增殖的能力,使Ki67核抗原表達增多,最終使細胞失去控制,并向癌變發(fā)展。表明p16和Ki67參與了NSCLC的發(fā)生,且p16表達缺失和Ki67指數(shù)高的腫瘤分裂增殖快、易轉(zhuǎn)移和預(yù)后差,因此,p16和Ki67表達對NSCLC術(shù)后轉(zhuǎn)移、生存率及生存期預(yù)后的估計可能有一定的指導(dǎo)意義。

    綜上所述,p16蛋白和Ki67抗原在肺癌中的研究有著廣闊的前景,其不僅在肺癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,而且對肺癌患者的預(yù)后有一定的估計價值。相信隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展,p16和Ki67基因會成為肺癌進行基因治療的靶基因。

    [1]Belani CP,Liao J.Maintenance therapy for non-small cell lung cancer.Lancet,2010,375(9711):281-282

    [2]Dahlberg SE,Sandler AB,Brahmer JR,et al.Clinical course of advanced non-small cell lung cancer patients experiencing hypertension during treatment with bevacizumab in combination with carboplatin and paclitaxel on ECOG 4599.J Clin Oncol,2010,28(6):949-954

    [3]Jemal A,Center MM,Desantis C,et al.Global patterns of cancer incidence and mortality rates and trends.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.2010,19(8):1893-1907

    [4]Suresh S,Ramalingam,MD,Taofeek K,et al.Lung cancer:new biological insights and recent therapeutic advances.CA Cancer J Clin,2011,61(2):91-112

    [5]張軍航,馬琳,劉芙蓉,等.肺癌組織中p16基因mRNA的表達及其臨床意義.中華實驗外科雜志,2004,21(4):464-465

    [6]Geradt SJ,Ingram CD.Abnormal expression of cell cycle regulatory proteins inductal and lobular carcinomas of the breast.Mod Pat Hol,2000,13(9):945-953

    [7]劉鵬熙,陳前軍,鐘少文,等.新輔助化療對乳腺癌P170、Ki67、P53的影響.腫瘤,2006,26(2):168

    [8]Gentile V,Vicini P,Gicaomenlli,et al.Detection of human papillomavirus DNA,p53and ki67expression in penile carcinomas.Int J Immunopathol Pharmacol,2006,19(1):209-215

    [9]Jalava P,Kuopio T,Juntti-Patinen L,et al.Ki67immunohistochemistry:a valuable marker in prognostication but with a risk of misclassification:proliferation subgroups formed based on Ki67immunoreactivity and standardized mitotic index.Histopathology,2006,48(6):674-682

    [10]Jin M,Inoue S ,Umemura T,et al.CyclinD1,p16 and retinoblastoma gene product expression as a predict or for prognosis in non-small cell lung cancer at stagesⅠandⅡ.Lung Cancer,2001,34(2):207-218

    [11]Gessner C,Liebers U,Kuhn H,et al.BAX and p16 INK4aare independent positive prognostic markers for advanced tumour stage of non-small cell lung cancer.Eur Respir J,2002,19(1):134-140

    [12]Carlos VJ,Herrero ZA,F(xiàn)resno MF,et al.Expression of cyclin D1and Ki-67in squamous cell carcinoma of the oral cavity:clinicopathological and prognostic significance.Oral Oncol,2002,38(3):301-308

    Expression of p16and Ki67and their correlation with prognosis in non-small cell lung cancer

    Wu Shiwu,Cheng Zenong,Yu Lan,Song Wenqing,Tao Yisheng*
    (Department of Pathology,Bengbu Medical College,The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College,Anhui 233000,China)

    Objective To study the expression of p16and Ki67in non-small cell lung cancer(NSCLC),and explore their correlation with prognosis and chinicopathologic factors of NSCLC.Methods The expression of p16and Ki67proteins in 160specimens of NSCLC and 20normal lung tissue was detected by immunohistochemistry.Results The positive rates of p16and Ki67proteins in NSCLC were 23.8%and 82.5%respectively,but 90%and 5%in normal lung tissue.There was a significant difference between the two (P<0.05).There was a negative correlation between the expression of p16and that of Ki67in NSCLC.PTNM staging、lymph node metastasis and positive expression of p16and Ki67were independent prognosis factors of NSCLC (P<0.05).The five-year survival rate was significantly different between the p16-positive and p16-negative group (55.3%vs 18.0%),and between the Ki67-negative and Ki67-positive groups(42.9%vs 23.5%).Conclusion Ki67and p16may be involved in the initiation and development of NSCLC,and the level of p16and Ki67is correlated to the progression and prognosis of NSCLC.

    Non-small cell lung cancer;p16;Ki67;Prognosis

    R734.2

    A

    10.3870/zgzzhx.2011.06.014

    2011-06-21

    2011-09-20

    武世伍,男(1977年),漢族,碩士。

    *通訊作者(To whom correspondence should be addressed)

    猜你喜歡
    分化陰性淋巴結(jié)
    兩次中美貨幣政策分化的比較及啟示
    喉前淋巴結(jié)與甲狀腺乳頭狀癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究
    分化型甲狀腺癌切除術(shù)后多發(fā)骨轉(zhuǎn)移一例
    淋巴結(jié)腫大不一定是癌
    鉬靶X線假陰性乳腺癌的MRI特征
    三陰性乳腺癌的臨床研究進展
    hrHPV陽性TCT陰性的婦女2年后隨訪研究
    頸部淋巴結(jié)超聲學(xué)分區(qū)
    黃癸素對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的體內(nèi)外抑制作用
    Cofilin與分化的研究進展
    久久精品久久精品一区二区三区| 最近最新中文字幕免费大全7| 日日撸夜夜添| 欧美另类一区| 各种免费的搞黄视频| av免费在线看不卡| 有码 亚洲区| 亚洲高清免费不卡视频| 午夜激情av网站| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产免费现黄频在线看| 超色免费av| 一级片'在线观看视频| 91久久精品国产一区二区成人| 欧美日韩av久久| 99久久人妻综合| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲成人av在线免费| 在线观看免费日韩欧美大片 | 一区二区三区四区激情视频| 一区二区三区免费毛片| 在现免费观看毛片| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲欧美色中文字幕在线| 大香蕉久久网| 国产极品天堂在线| 午夜激情久久久久久久| 久久午夜福利片| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 少妇人妻精品综合一区二区| 妹子高潮喷水视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产欧美亚洲国产| av在线观看视频网站免费| 久久久国产一区二区| 精品久久久精品久久久| 亚洲精品中文字幕在线视频| 秋霞伦理黄片| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 精品久久久久久久久亚洲| 精品一区在线观看国产| 热99国产精品久久久久久7| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 中国美白少妇内射xxxbb| av网站免费在线观看视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 一区二区三区四区激情视频| 久久久精品区二区三区| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 视频区图区小说| 综合色丁香网| 日韩亚洲欧美综合| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 看免费成人av毛片| 国产精品久久久久久久电影| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 免费观看性生交大片5| 欧美精品亚洲一区二区| 国产高清三级在线| 国产精品一区二区在线观看99| 国产黄色免费在线视频| 亚洲综合色网址| 亚洲高清免费不卡视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 少妇精品久久久久久久| 一个人免费看片子| 亚洲久久久国产精品| 亚洲在久久综合| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 黑人高潮一二区| 亚洲国产最新在线播放| 欧美成人精品欧美一级黄| 午夜福利,免费看| 亚洲av国产av综合av卡| 久久人人爽人人爽人人片va| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 男人添女人高潮全过程视频| 成人免费观看视频高清| 国产一区二区三区av在线| 精品久久国产蜜桃| 美女cb高潮喷水在线观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 亚洲精品久久午夜乱码| 日韩一区二区三区影片| 久久这里有精品视频免费| 寂寞人妻少妇视频99o| 一级毛片 在线播放| 午夜91福利影院| 九九爱精品视频在线观看| 国产精品.久久久| 婷婷色综合大香蕉| 日韩成人av中文字幕在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 成年女人在线观看亚洲视频| 欧美三级亚洲精品| 成人国语在线视频| 99九九在线精品视频| 99热这里只有精品一区| 国产一区二区三区综合在线观看 | 国产成人精品婷婷| 丰满少妇做爰视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产免费现黄频在线看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 日日爽夜夜爽网站| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 99re6热这里在线精品视频| 国产黄频视频在线观看| 中国国产av一级| 三级国产精品片| 亚洲精品一二三| 国产精品国产三级专区第一集| a级毛片免费高清观看在线播放| a级毛片黄视频| 成人综合一区亚洲| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲精品国产av成人精品| 乱码一卡2卡4卡精品| 岛国毛片在线播放| 国产精品偷伦视频观看了| 成人影院久久| 日韩一区二区三区影片| 日韩成人伦理影院| 欧美精品一区二区免费开放| 视频中文字幕在线观看| 亚洲成人一二三区av| 中国美白少妇内射xxxbb| 成人手机av| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 少妇熟女欧美另类| 亚洲欧美成人精品一区二区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| av天堂久久9| 欧美丝袜亚洲另类| 午夜福利,免费看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 啦啦啦在线观看免费高清www| a级毛片黄视频| 秋霞伦理黄片| 这个男人来自地球电影免费观看 | 韩国av在线不卡| 亚洲国产精品999| 街头女战士在线观看网站| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产精品久久久久久av不卡| 18禁观看日本| 黑丝袜美女国产一区| 久久久久久久久大av| 午夜福利视频精品| 纯流量卡能插随身wifi吗| 五月开心婷婷网| 日韩制服骚丝袜av| 久久午夜福利片| 丝袜喷水一区| 永久免费av网站大全| 亚洲欧洲日产国产| 丝袜脚勾引网站| 考比视频在线观看| 91国产中文字幕| 久久精品久久精品一区二区三区| 18禁观看日本| 色网站视频免费| 久久久久久久久大av| 亚洲av免费高清在线观看| 美女中出高潮动态图| 母亲3免费完整高清在线观看 | 久久狼人影院| 欧美+日韩+精品| 大话2 男鬼变身卡| 国产精品人妻久久久影院| 久久久久网色| 国产不卡av网站在线观看| 91国产中文字幕| 在线观看国产h片| 超碰97精品在线观看| 国产在线免费精品| 日韩制服骚丝袜av| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲无线观看免费| 美女主播在线视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 91久久精品电影网| 国产精品三级大全| 日韩一区二区三区影片| 黄色配什么色好看| 女人精品久久久久毛片| 久久国内精品自在自线图片| 日本91视频免费播放| 久久久久国产网址| 在线观看免费日韩欧美大片 | 欧美日韩视频精品一区| 一区二区三区精品91| 青青草视频在线视频观看| 亚洲不卡免费看| 欧美xxⅹ黑人| 欧美国产精品一级二级三级| 久久99热6这里只有精品| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 久久99精品国语久久久| 黄色怎么调成土黄色| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 性高湖久久久久久久久免费观看| 91国产中文字幕| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久久精品区二区三区| 欧美激情国产日韩精品一区| 日本午夜av视频| 午夜91福利影院| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 日韩成人伦理影院| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 激情五月婷婷亚洲| 久久人人爽人人片av| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 男女边摸边吃奶| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产精品熟女久久久久浪| 纯流量卡能插随身wifi吗| 精品人妻熟女毛片av久久网站| av播播在线观看一区| 日本wwww免费看| 人人妻人人澡人人看| 亚洲精品国产av成人精品| av专区在线播放| 街头女战士在线观看网站| 嫩草影院入口| 美女中出高潮动态图| 成人黄色视频免费在线看| 日韩免费高清中文字幕av| 少妇的逼水好多| av福利片在线| 在现免费观看毛片| 欧美激情国产日韩精品一区| 女人精品久久久久毛片| 少妇人妻精品综合一区二区| 女人久久www免费人成看片| 啦啦啦在线观看免费高清www| 丰满饥渴人妻一区二区三| av在线播放精品| 飞空精品影院首页| 国产在线免费精品| 大片电影免费在线观看免费| 午夜激情av网站| 亚洲精品美女久久av网站| 十分钟在线观看高清视频www| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产成人freesex在线| 亚洲国产精品专区欧美| 人妻少妇偷人精品九色| 久久鲁丝午夜福利片| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产精品一区二区在线观看99| 色哟哟·www| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产成人av激情在线播放 | 亚洲性久久影院| 女人精品久久久久毛片| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲成色77777| 免费av中文字幕在线| 国产爽快片一区二区三区| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 在线观看人妻少妇| 国产精品成人在线| 日韩欧美精品免费久久| 日韩成人伦理影院| 久久久久久久久大av| 亚洲人与动物交配视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲精品亚洲一区二区| 一级片'在线观看视频| 亚洲欧美清纯卡通| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 免费黄网站久久成人精品| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久 成人 亚洲| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 观看av在线不卡| 国产黄片视频在线免费观看| 久久久国产欧美日韩av| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 少妇人妻 视频| 97精品久久久久久久久久精品| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产精品人妻久久久影院| 国产精品蜜桃在线观看| 满18在线观看网站| 久久97久久精品| 国产色婷婷99| 少妇人妻 视频| 韩国av在线不卡| 九九在线视频观看精品| 搡老乐熟女国产| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产精品成人在线| 日本欧美国产在线视频| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 国产高清有码在线观看视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 少妇被粗大猛烈的视频| 97精品久久久久久久久久精品| 久久久久久久久久人人人人人人| 黄片播放在线免费| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 精品国产一区二区久久| 国产日韩欧美视频二区| 日本免费在线观看一区| 亚洲精品久久午夜乱码| 99久久精品一区二区三区| 亚洲国产av新网站| 久久久精品区二区三区| 永久免费av网站大全| 亚洲成人手机| 麻豆成人av视频| 有码 亚洲区| av黄色大香蕉| 欧美日韩精品成人综合77777| 人妻少妇偷人精品九色| 人体艺术视频欧美日本| 免费观看性生交大片5| 久久毛片免费看一区二区三区| 成人国语在线视频| 亚洲人成网站在线播| 亚洲精品亚洲一区二区| 99久国产av精品国产电影| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 欧美日韩在线观看h| 国产 精品1| 黑丝袜美女国产一区| 精品少妇久久久久久888优播| 赤兔流量卡办理| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲人成网站在线播| 亚洲精品,欧美精品| 下体分泌物呈黄色| 国产熟女欧美一区二区| 91精品国产国语对白视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 少妇的逼好多水| 久久久国产欧美日韩av| 搡女人真爽免费视频火全软件| 麻豆乱淫一区二区| 满18在线观看网站| 国模一区二区三区四区视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 精品一区二区免费观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 国产精品蜜桃在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲国产色片| 欧美日韩综合久久久久久| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产成人精品婷婷| 精品人妻一区二区三区麻豆| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产视频内射| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲四区av| 99视频精品全部免费 在线| 国产高清有码在线观看视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲人成网站在线播| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 一本久久精品| 成人亚洲精品一区在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看| 尾随美女入室| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 久久婷婷青草| 黑人高潮一二区| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 最新中文字幕久久久久| 嘟嘟电影网在线观看| 大香蕉久久成人网| 免费黄色在线免费观看| 国产精品不卡视频一区二区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| av女优亚洲男人天堂| 91精品三级在线观看| 欧美国产精品一级二级三级| 青春草视频在线免费观看| 久久久久视频综合| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 春色校园在线视频观看| 成人免费观看视频高清| 亚洲色图综合在线观看| 久久久久久久久久成人| 男女高潮啪啪啪动态图| 成人综合一区亚洲| 亚州av有码| 丁香六月天网| 极品人妻少妇av视频| 九九爱精品视频在线观看| av福利片在线| 飞空精品影院首页| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 久久午夜福利片| 久久精品人人爽人人爽视色| 国精品久久久久久国模美| 久久鲁丝午夜福利片| 日本av手机在线免费观看| 熟女av电影| 国产片内射在线| 日韩一区二区视频免费看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 97在线人人人人妻| 制服诱惑二区| 欧美丝袜亚洲另类| 男女啪啪激烈高潮av片| a级毛片黄视频| 永久免费av网站大全| 国产老妇伦熟女老妇高清| 永久网站在线| 国模一区二区三区四区视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 免费观看无遮挡的男女| 日韩一区二区视频免费看| 久久免费观看电影| 亚洲四区av| 精品熟女少妇av免费看| 性色avwww在线观看| 99视频精品全部免费 在线| 插阴视频在线观看视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国模一区二区三区四区视频| 大陆偷拍与自拍| 最后的刺客免费高清国语| 99国产综合亚洲精品| 日韩欧美精品免费久久| 精品国产露脸久久av麻豆| 婷婷色综合www| 日本免费在线观看一区| 亚洲综合精品二区| 久久国产精品大桥未久av| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 久久国产精品大桥未久av| 精品国产国语对白av| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 色吧在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 久久久久视频综合| 日韩视频在线欧美| 久久久久久久久大av| 午夜福利视频在线观看免费| 一本色道久久久久久精品综合| videos熟女内射| 日韩大片免费观看网站| 91成人精品电影| 亚州av有码| 男人添女人高潮全过程视频| 一级a做视频免费观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 一级片'在线观看视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 久久人人爽人人片av| 只有这里有精品99| 999精品在线视频| 最黄视频免费看| 三上悠亚av全集在线观看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲不卡免费看| 女人精品久久久久毛片| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 午夜激情久久久久久久| 在线观看免费视频网站a站| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲精品一二三| 日本av手机在线免费观看| av有码第一页| 国产黄片视频在线免费观看| 久久久精品免费免费高清| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 五月玫瑰六月丁香| 中文字幕久久专区| 亚洲综合色网址| 久久久久久久久久久丰满| 国产精品一国产av| 九九爱精品视频在线观看| 69精品国产乱码久久久| 亚洲精品成人av观看孕妇| 永久免费av网站大全| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 欧美精品一区二区免费开放| 香蕉精品网在线| 视频区图区小说| 丝袜喷水一区| 少妇的逼好多水| kizo精华| 免费观看性生交大片5| 色94色欧美一区二区| 插阴视频在线观看视频| 国产免费一级a男人的天堂| 少妇人妻精品综合一区二区| 2022亚洲国产成人精品| 欧美3d第一页| 国产国语露脸激情在线看| 涩涩av久久男人的天堂| 久久久久久久久大av| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 丝袜喷水一区| 国产男女内射视频| 熟女av电影| 中文字幕av电影在线播放| 99国产综合亚洲精品| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲av国产av综合av卡| 国产69精品久久久久777片| 最黄视频免费看| 91成人精品电影| 国产精品免费大片| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 大香蕉久久网| av电影中文网址| 久久久久久久久久久久大奶| 国产日韩欧美视频二区| 一区在线观看完整版| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 精品久久蜜臀av无| 少妇的逼水好多| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲人成77777在线视频| 日本欧美国产在线视频| 视频在线观看一区二区三区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 七月丁香在线播放| 一级毛片aaaaaa免费看小| 9色porny在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲精品视频女| 亚洲av不卡在线观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 青春草视频在线免费观看| 久久影院123| 久久久久久久久久久免费av| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲av二区三区四区| 亚洲综合精品二区| av网站免费在线观看视频| 国产精品一二三区在线看| 少妇丰满av| 久久精品人人爽人人爽视色| 精品少妇内射三级| 永久网站在线| 97精品久久久久久久久久精品| 中文欧美无线码| 免费黄网站久久成人精品| 中国三级夫妇交换| 人妻 亚洲 视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产在线视频一区二区| 成人无遮挡网站| 国产成人精品无人区| 国产视频内射| 最新中文字幕久久久久| 少妇精品久久久久久久| av一本久久久久| 免费大片黄手机在线观看| 精品国产国语对白av| 午夜福利网站1000一区二区三区| 三级国产精品片| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 中文字幕免费在线视频6| 国产精品人妻久久久影院| 在线播放无遮挡| 色视频在线一区二区三区| 国产精品一区二区在线观看99| 在线 av 中文字幕| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 欧美 日韩 精品 国产| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 两个人免费观看高清视频| 综合色丁香网| 国产有黄有色有爽视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 日本色播在线视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 欧美少妇被猛烈插入视频| 看免费成人av毛片| 精品国产国语对白av| 国产精品 国内视频| 中文字幕亚洲精品专区| 一级毛片 在线播放| 国产午夜精品一二区理论片| 日日摸夜夜添夜夜爱| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲av综合色区一区| 久久久久久伊人网av| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 色哟哟·www| 国产欧美亚洲国产| av电影中文网址| 欧美日韩综合久久久久久| 色婷婷久久久亚洲欧美| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产深夜福利视频在线观看|