老年低額溞卵黃蛋白的分離純化及性質(zhì)

郭艷敏，謝松，柳峰松，趙麗坤，趙海

（1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.保定學(xué)院 生物系，河北 保定 071000）

老年低額溞卵黃蛋白的分離純化及性質(zhì)

郭艷敏1，謝松1，柳峰松1，趙麗坤1，趙海2

（1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.保定學(xué)院 生物系，河北 保定 071000）

為了研究老年低額溞卵黃蛋白（vitellion，Vn）在環(huán)境檢測中的應(yīng)用，采用制備電泳方法，從老年低額溞整體勻漿液提取的粗蛋白中純化其Vn.聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）檢測表明，SephadexG-100得不到高純度的Vn，制備電泳可以得到高純度的Vn，達(dá)到了實驗要求.對老年低額溞Vn的性質(zhì)進(jìn)行研究，老年低額溞Vn總分子質(zhì)量為389 900 u，含有5種亞基，分子質(zhì)量分別為76 500，63 000，59 200，52 700，47 200 u，含有2個二硫鍵，等電點(diǎn)為5.0～5.5，是一種酸性蛋白.

老年低額溞；卵黃蛋白；層析；制備電泳

1954年 Telfer［1］發(fā)現(xiàn)了雌性特異蛋白（female specific protein，F(xiàn)SP），1969年 Pan［2］等命名此蛋白為卵黃蛋白（vitellin，Vn）.現(xiàn)已確認(rèn)Vn是一種高密度糖脂蛋白，是卵生非哺乳動物體內(nèi)一種雌性特異蛋白［3］，存在于成熟雌性個體的卵中［4］.

近年來對于魚類卵黃蛋白原在環(huán)境檢測方面的研究較多［5-7］，此外Lee等［8］還克隆了日本虎斑猛水蚤卵黃蛋白原的啟動子，發(fā)現(xiàn)其啟動子區(qū)不但含有雌性激素應(yīng)答元件，還含有一個金屬應(yīng)答元件，可以受到重金屬鎘的誘導(dǎo)調(diào)控.經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織已經(jīng)將卵黃蛋白原作為環(huán)境雌激素化學(xué)物理想的暴露標(biāo)志物［9］，卵黃蛋白原是Vn前體，在卵巢發(fā)育后期，被卵巢中的卵母細(xì)胞吸收后經(jīng)剪切修飾轉(zhuǎn)化成Vn［4］.

老年低額溞是一種小型甲殼類動物，繁殖速度快，一般5～8 d就能達(dá)到性成熟，其卵黃蛋白原很快轉(zhuǎn)化成Vn；另外老年低額溞又是一種較低級的水生生物，對環(huán)境污染物的刺激比較敏感［10］，所以其Vn很容易受水體環(huán)境的影響.目前對于像枝腳類這類小型甲殼動物的Vn研究較少.老年低額溞分布廣泛，是環(huán)境監(jiān)測的理想材料，對其Vn進(jìn)行純化具有重要的意義.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2010年9月于保定市護(hù)城河撈取混合溞類，在實驗室進(jìn)行純培養(yǎng)，純化得到老年低額溞.

1.2 實驗方法

1.2.1 粗蛋白的制備

將老年低額溞從魚缸撈出，沖洗干凈，吸干其表面的水.用4倍體積的0.02 mol／L，p H 8.0的Tris-HCl緩沖液混合后放入研缽中研磨，8 000 r／min離心10 min，棄沉淀，取上清液于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.2 Vn的鑒定

銀染色：專門挑選無卵的老年低額溞，提取其粗蛋白，與有卵老年低額溞的粗蛋白天然-PAGE比較，電泳結(jié)束后用銀染色［11］.

高碘酸-Schiff試劑染色［12］：采用天然-PAGE，電泳結(jié)束后用高碘酸-Schiff試劑染色.

飽和乙酰蘇丹黑染色［12］：將粗蛋白與飽和乙酰蘇丹黑以體積比10∶1混合，置37℃水浴保溫30 min，再與400 g／L蔗糖1∶1混合后進(jìn)行電泳.

1.2.3 Vn的純化

凝膠過濾層析法［13］純化 Vn：將SephadexG-100用0.01 mol／L，p H 7.0 Tris-HCl緩沖液充分平衡后，取0.5 m L粗蛋白上柱，同種緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為13.3 m L／h，收集各洗脫峰，透析濃縮，以天然-PAGE檢測Vn.

制備電泳法［4］純化Vn：制備電泳中濃縮膠質(zhì)量濃度為36 g／L，分離膠質(zhì)量濃度為45 g／L，回收后用天然-PAGE檢測其純度.

1.2.4 Vn的性質(zhì)總分子質(zhì)量的測定：純化的Vn采用梯度電泳［14-15］測定其總分子質(zhì)量，梯度膠質(zhì)量濃度為40～150 g／L.亞基數(shù)目及其分子質(zhì)量的測定：采用SDS-PAGE法［16-18］.

二硫鍵數(shù)目的測定：采用SDS-PAGE法，巰基乙醇用于二硫鍵的還原，用含有巰基乙醇的樣品緩沖液和不含巰基乙醇的樣品緩沖液分別電泳［16］，比較兩者亞基數(shù)目.

等電點(diǎn)測定：用聚丙烯酰胺凝膠平板等電聚焦電泳［19］測定Vn的等電點(diǎn).

2 實驗結(jié)果

2.1 Vn的鑒定

2.1.1 銀染色

圖1顯示，有卵老年低額溞比無卵老年低額溞明顯多出1種蛋白組分，并且該組分含量豐富.由于Vn只存在于動物的卵內(nèi)，且是卵黃的主要成分，在無卵動物體內(nèi)并不存在［4］，另參照 Quinitio［20］等相關(guān)研究，可確定該蛋白組分為Vn.

2.1.2 高碘酸-Schiff試劑染色和飽和乙酰蘇丹黑染色

由圖2可知，Vn可同時被高碘酸-Schiff試劑和飽和乙酰蘇丹黑著色，說明是一種糖脂蛋白，與已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的其他動物的Vn該項性質(zhì)相符［4，16］.

圖1 銀染色Fig.1 Silver staining

圖2 高碘酸-Schiff試劑染色和飽和乙酰蘇丹黑染色Fig.2 Dyeing by periodic acid-Schiff and saturated acetyl sudan black

2.2 Vn的純化

粗蛋白經(jīng)Sephadex G-100層析，得到2個洗脫峰（圖3），天然-PAGE檢測2個洗脫峰都含有Vn，且每個洗脫峰都不止含有Vn，電泳圖譜上位置離Vn接近的蛋白組分在2個洗脫峰中也都含有（圖4），可見經(jīng)Sephadex G-100層析不能得到高純度的Vn.后將粗蛋白進(jìn)行制備電泳，將回收的Vn透析濃縮，天然-PAGE檢測，結(jié)果顯示能得到較純的Vn（圖5）.

圖3 凝膠過濾層析法分離老年低額溞VnFig.3 Gel filtration chromatography separating Simocephalusvetulus'vitellion

圖4 凝膠過濾層析各洗脫峰蛋白PAGE電泳Fig.4 PAGE of protein in two elutionpeaks of gel filtration chromatography

圖5 制備電泳所得蛋白PAGE電泳Fig.5 PAGE of protein from preparative electrophoresis

2.3 Vn的性質(zhì)

2.3.1 Vn總分子質(zhì)量和各個亞基分子質(zhì)量的測定

梯度電泳測得Vn的總分子質(zhì)量為389 900 u（圖6 a）；SDS-PAGE結(jié)果顯示，使用巰基乙醇的泳道比沒有使用巰基乙醇的泳道多出2個亞基，因此Vn含有2個二硫鍵（圖6 b）；SDS-PAGE法測得Vn含有5種亞基，各亞基的分子質(zhì)量為76 500，63 000，59 200，52 700，47 200 u（圖6 c）.

圖6 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測純化VnFig.6 PAGE of purified vitellion

2.3.2 等電點(diǎn)的測定

聚丙烯酰胺凝膠平板等電聚焦電泳測定Vn的等電點(diǎn)為5.0～5.5，是一種酸性蛋白.

3 討論

老年低額溞是一種小型甲殼動物，最大的體長只有2～3 mm，卵粒更小.以往對水產(chǎn)動物Vn的研究大都集中于魚類，采用直接對卵巢進(jìn)行研究的方法，對于老年低額溞這種小個體，不宜對其卵巢進(jìn)行分離，對其整體進(jìn)行研究，較為便捷.

卵黃蛋白原是Vn的前體，兩者都為糖脂蛋白，且荷電性質(zhì)，分子質(zhì)量大小等都極為相近.本實驗中高碘酸-Schiff試劑染色和飽和乙酰蘇丹黑染色時，電泳圖譜上位置在Vn上方很近的一種蛋白組分也同時著色（圖2），且在有卵與無卵的老年低額溞體內(nèi)均出現(xiàn)（圖1），考慮到卵黃蛋白原通常出現(xiàn)在體液中，推斷這一蛋白組分是卵黃蛋白原.

凝膠過濾層析方法按分子質(zhì)量大小分離蛋白，本實驗?zāi)z過濾層析方法不能分離出Vn；采用制備電泳的方法純化Vn可得到滿意的效果.

本實驗證明Vn是一種高分子質(zhì)量蛋白，同時含有糖基和脂基.有研究證明Vn含有類胡蘿卜素［16］，在制備電泳過程中，如果上樣量足夠大，在沒有染色的情況下，就可以在Vn所處的位置看到一條很粗的淺黃色條帶，推斷這種現(xiàn)象與Vn含有類胡蘿卜素有關(guān).

近年來關(guān)于Vn亞基的研究報道多集中在魚類、蝦、昆蟲等動物.如小體鱘Vn由9個亞基組成［21］；中國明對蝦Vn由5個亞基組成［16］；紅褐斑腿蝗Vn由7個亞基組成［22］.本實驗證明老年低額溞Vn也是一種多亞基蛋白，有5種不同的亞基，但是從總分子質(zhì)量和各種亞基分子質(zhì)量總和來看，總分子質(zhì)量大于各亞基分子質(zhì)量之和，判斷老年低額溞Vn的某些亞基在1個以上.

本實驗證明老年低額溞Vn含有2個二硫鍵，是一種酸性蛋白.

卵黃蛋白原是Vn的前體物質(zhì)，在卵巢發(fā)育后期，被卵巢中的卵母細(xì)胞吸收后經(jīng)剪切修飾，轉(zhuǎn)化成Vn儲存在卵中.王浩等對Vn和卵黃蛋白原之間存在的免疫交叉反應(yīng)的研究，表明Vn和卵黃蛋白原之間具有免疫同源性.根據(jù)這一性質(zhì)，考慮可以通過酶聯(lián)免疫吸附方法來檢測Vn的微量變化［23］，用于評估環(huán)境雌激素化學(xué)物的影響，老年低額溞Vn的分離純化和性質(zhì)研究可為將來在環(huán)境評估方面的應(yīng)用打下基礎(chǔ).

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Purification and Properties of Vitellion FromSimocephalusvetulus

GUO Yan-min1，XIE Song1，LIU Feng-song1，ZHAO Li-kun1，ZHAO Hai2
（1.College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China；2.Department of Biology，Baoding College，Baoding 071000，China）

In order to study the application ofSimocephalusvetulus'vitellion in the environment testing，from homogenate liquid ofS.vetulus，preparative electrophoresis was used to purify vitellion.Protein was detected by polyacrylamide gel electrophoresis，it indicated that chromatography （Sephadex G-100）couldn't guarantee high-purity of vitellion.Preparative electrophoresis showed that the high purity of the protein could be obtained.Properties ofS.vetulus'vitellion was analysed.Molecular mass of the protein was 389 900 u.Five subunits were found and their molecular mass were 76 500，63 000，59 200，52 700，47 200 u.The protein had two disulfides.Its p I was 5.0～5.5，and it was a acidic protein.

Simocephalusvetulus；vitellion；chromatography；preparative electrophoresis

Q 513

A

1000-1565（2011）06-0643-05

2011-06-28

河北省自然科學(xué)基金資助項目（C2010000256）

郭艷敏（1984-），女，河北邯鄲人，河北大學(xué)在讀碩士研究生.

謝松（1964-），男，江西吉安人，河北大學(xué)教授，博士，主要從事水生生物學(xué)研究.

E-mail：xiesong＠hbu.edu.cn

趙藏賞）