中華鋸齒米蝦卵黃蛋白的純化鑒定

穆淑梅，楊炎，2，孫世杰，康現(xiàn)江

（1.河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002；2.華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司 生物產(chǎn)品中心，河北 石家莊 050035）

中華鋸齒米蝦卵黃蛋白的純化鑒定

穆淑梅1，楊炎1，2，孫世杰1，康現(xiàn)江1

（1.河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002；2.華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司 生物產(chǎn)品中心，河北 石家莊 050035）

為了研究中華鋸齒米蝦卵黃蛋白的性質(zhì)，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用不同的染色方法對其進行分析鑒定，并采用電泳洗脫法從中華鋸齒米蝦成熟卵巢中將其分離純化.研究結(jié)果表明，中華鋸齒米蝦成熟卵巢中的卵黃蛋白為糖脂復合蛋白，該蛋白分子質(zhì)量為434ku.利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)分析該卵黃蛋白由3個主要亞基組成，分子質(zhì)量分別為108，89，78ku.

中華鋸齒米蝦；卵黃蛋白；電泳洗脫；純化；鑒定

卵生動物中，卵黃生成是卵母細胞發(fā)育過程中的一個重要步驟，也是一個營養(yǎng)儲備的過程，將蛋白質(zhì)、脂肪、糖等營養(yǎng)物質(zhì)儲存到卵子中以備胚胎發(fā)育之需［1-2］.而卵子中卵黃的主要成分是卵黃蛋白（vitellin，Vn），因此，該蛋白的合成也就成為考察雌性動物生殖能力的一個很好的指標.雌性動物中，卵黃蛋白原（vitellogenin，Vg）是卵黃蛋白的前體，產(chǎn)生之后經(jīng)由血淋巴運送到卵母細胞，經(jīng)過一系列修飾及分解作用轉(zhuǎn)化成卵黃蛋白，與卵黃蛋白有著免疫同一性［3］.

卵黃蛋白（原）通常僅存在于雌性動物中，但是現(xiàn)在也有其在雄性動物中出現(xiàn)的報道，這通常與動物的內(nèi)分泌紊亂或環(huán)境激素引發(fā)的不良效應(yīng)有關(guān)［2，4］.因此，卵黃蛋白（原）的存在也常用于研究激素參與的生殖調(diào)控［1］以及評估環(huán)境激素引發(fā)的不良生理效應(yīng)［2，4-5］等方面.那么，在研究卵黃蛋白的合成以及激素（外源、內(nèi)源）的調(diào)控（影響）作用之前，有必要對卵黃蛋白進行分離純化和性質(zhì)研究，為后續(xù)的抗體制備以及在此基礎(chǔ)之上所做的上述研究提供基礎(chǔ)資料.

目前有關(guān)甲殼動物卵黃蛋白性質(zhì)的研究國內(nèi)外已有很多的報道，已經(jīng)分離出日本對蝦（Penaeus japonicus）［6］、斑節(jié)對蝦（P.monodon）［7］、短溝對蝦（P.semisulcatus）［8］、南美白對蝦（P.vannamei）［8］、凡納濱 對 蝦 （Litopenaeusmerguiensis）［9］、克 氏 原 螯 蝦 （Procambiusclarkii）［10］、紅 螯 光 殼 螯 蝦 （Cherax quadricarinatus）［11］、日本沼蝦（Macrobrachiumnipponense）［12］、羅氏沼蝦（M.rosenbergii）［13］等種類的卵黃蛋白.卵黃蛋白的提純方法主要有高效液相色譜儀法、密度梯度離心法、蔗糖-EDTA-硫酸銨沉淀法、凝膠過濾-陰離子交換層析法、電泳洗脫法等.

本實驗以中華鋸齒米蝦為實驗材料，采用電泳洗脫法從其成熟卵巢中分離純化卵黃蛋白，利用梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳和SDS-PAGE分析卵黃蛋白的性質(zhì)，為卵黃蛋白的合成等研究提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用中華鋸齒米蝦購自河北安新，產(chǎn)于白洋淀天然水體.選取卵巢發(fā)育成熟的中華鋸齒米蝦，冰浴條件下將其解剖，迅速取出卵巢備用.

1.2 試劑

天然高分子質(zhì)量標準蛋白：Bovine serum albumin（67ku），Lactate dehydrogenase（140ku），Catalase（232ku），F(xiàn)erritin（440ku），Thyroglobulin（669ku），Pharmaica.

SDS-高分子質(zhì)量標準蛋白：Glutamate dehydrogenase（53ku），Transferrin （76ku），β-Galactosidase（116ku），α-2-Macroglobulin（170ku），Myosin（220ku），Pharmaica.

1.3 儀器

JA2003電子天平，上海精科；Phs-3C酸度計，上海偉業(yè)儀器廠；Sigma 2-16K高速冷凍離心機；DYY-Ⅲ6B恒流穩(wěn)壓電泳儀、DYC-Z24D電泳槽、DYC-Z40A回收電泳槽，均為北京六一儀器廠產(chǎn)品；Uniscan B880掃描儀，清華紫光股份有限公司.

1.4 方法

1.4.1 卵巢粗提液的制備

取中華鋸齒米蝦成熟卵巢，電子天平上稱取0.5g，加入5mL預冷的蛋白提取液（0.5mol／L Tris-HCl，2mmol／L EDTA，0.1mol／L NaCl，0.1mmol／L PMSF，pH 7.4）勻漿.將勻漿液離心15min（4℃，10 000r／min），棄除上層油脂和下層沉淀，余者即為卵巢粗提液.

1.4.2 卵黃蛋白的鑒定

非變性條件下聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）分析其卵巢粗提液，所用分離膠質(zhì)量分數(shù)為6%，pH 8.9.電泳結(jié)束，將膠板縱向分為3部分，分別進行糖蛋白染色（過碘酸-Schiff's試劑），脂蛋白染色（蘇丹黑B）以及考馬斯亮藍染色，分析蛋白性質(zhì)［12］.

1.4.3 電泳洗脫純化卵黃蛋白

成熟卵巢粗提液進行PAGE電泳（分離膠質(zhì)量分數(shù)6%，pH 8.9）后，采用電泳洗脫法對其卵黃蛋白進行純化［12］.

1.4.4 電泳分析卵黃蛋白分子質(zhì)量

采用梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳（分離膠質(zhì)量分數(shù)4%～15%，pH 8.9）分析上述純化卵黃蛋白的分子質(zhì)量，加入天然高分子質(zhì)量標準蛋白.

1.4.5 電泳分析卵黃蛋白亞基性質(zhì)

SDS-PAGE（分離膠質(zhì)量分數(shù)7%，pH 8.9）分析該卵黃蛋白亞基數(shù)目及分子質(zhì)量.用還原樣品緩沖液（含體積分數(shù)5% 的β-巰基乙醇和質(zhì)量分數(shù)2% 的SDS）處理樣品，加樣前沸煮10min，同時加入SDS-高分子質(zhì)量標準蛋白.

2 結(jié)果

2.1 卵黃蛋白的鑒定與純化

PAGE分析中華鋸齒米蝦成熟卵巢粗提液，結(jié)果顯示考馬斯亮藍、糖蛋白、脂蛋白3種染色方法同時呈現(xiàn)陽性的蛋白帶僅1條，而且遷移位置也一致（圖1）.其他學者的研究結(jié)果證實，甲殼動物的卵黃蛋白為具有高分子質(zhì)量的糖脂復合蛋白，所以可以確定本實驗中的這條3種染色均為陽性的蛋白帶即為中華鋸齒米蝦成熟卵巢中的卵黃蛋白.而在這條卵黃蛋白條帶下方還有一條考馬斯亮藍深染的蛋白條帶（圖1a），但脂蛋白和糖蛋白染色均呈陰性（圖1b，c），說明此蛋白非糖脂蛋白，同時證明染色鑒定卵黃蛋白的結(jié)果是可信的.此外，由于卵黃蛋白上結(jié)合有類胡蘿卜素，所以在電泳過程中和電泳結(jié)束后，可在凝膠上看到一條較淺的橙黃色條帶.這一結(jié)果與柳峰松等［14］的研究結(jié)果一致.

圖1 中華鋸齒米蝦卵巢粗提液聚丙烯酰胺凝膠電泳后卵黃蛋白的鑒定Fig.1 Identifying Vn from the matured ovaries of Neocaridinadenticulatasinensis via native PAGE

將電泳洗脫純化所得樣品進行PAGE驗證，考馬斯亮藍以及脂蛋白、糖蛋白特異染色結(jié)果均呈陽性（圖2），說明純化所得樣品即為卵黃蛋白.

圖2 純化卵黃蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳后的不同染色結(jié)果Fig.2 Native PAGE for the purified Vn with different staining means

2.2 卵黃蛋白及其亞基性質(zhì)分析

梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳分析已純化的卵黃蛋白，根據(jù)標準蛋白曲線確定其分子質(zhì)量為434ku（圖3）.經(jīng)SDS-PAGE分析，確定該蛋白由3個主要亞基組成，分子質(zhì)量分別為108，89，78ku（圖4）.

圖3 梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳分析卵黃蛋白的分子質(zhì)量Fig.3 Gradient PAGE for the molecular mass of Vn

圖4 SDS-聚丙烯凝膠電泳分析卵黃蛋白亞基及其分子質(zhì)量Fig.4 SDS-PAGE for the subunits and the molecular mass

3 討論

目前對已經(jīng)分離出的甲殼動物卵黃蛋白的研究一致認為，卵黃蛋白是一種高分子質(zhì)量的糖脂蛋白，因此，本實驗根據(jù)其這一特性，PAGE電泳后，通過糖蛋白、脂蛋白特異染色，對比考馬斯亮藍染色結(jié)果，分析確定了中華鋸齒米蝦成熟卵巢粗提液中的卵黃蛋白，隨后采用電泳洗脫法對該蛋白進行了分離純化.電泳洗脫法對于樣品中含量豐富的蛋白（如甲殼動物成熟卵巢中的卵黃蛋白）的回收純化是一種簡便而快捷的方法，且提純的蛋白純度較高，比較適用于蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析、分子質(zhì)量及亞基組成等性質(zhì)分析的研究.

實驗中采用聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳以及SDS-PAGE的方法，分別分析了中華鋸齒米蝦成熟卵巢中卵黃蛋白的總分子質(zhì)量及其亞基組成和各亞基分子質(zhì)量.中華鋸齒米蝦成熟卵巢中存在1種卵黃蛋白，其分子質(zhì)量為434ku，該蛋白由3個主要的亞基組成，分子質(zhì)量分別為108，89，78ku.由結(jié)果可以看出，3個亞基分子質(zhì)量之和與卵黃蛋白分子質(zhì)量稍有差距，但是，這在關(guān)于甲殼動物卵黃蛋白的性質(zhì)研究中是非常普遍的現(xiàn)象［6-13］，如謝松等［10］同樣采用電泳回收的方法對克氏原螯蝦的卵黃蛋白進行了純化，聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳分析其總分子質(zhì)量為481ku，SDS-PAGE結(jié)果顯示該蛋白具有6個亞基，分子質(zhì)量分別為198，176，132，111，92，82ku.究其原因，可能與分析蛋白分子質(zhì)量的方法有關(guān).在已有的研究中，通常均采用SDSPAGE來分析各物種卵黃蛋白的亞基組成及分子質(zhì)量［6-13］.SDS-PAGE分析蛋白分子質(zhì)量的原理在于SDS所帶的大量負電荷，消除或掩蓋了與其結(jié)合的不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，從而利用分子質(zhì)量差異將各種蛋白質(zhì)分開.但是SDS-PAGE亦有不足之處，如對于帶有較大輔基的蛋白（糖蛋白、脂蛋白等），由于它們的側(cè)鏈會直接影響蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合后的形狀，故不能確保電泳遷移率與蛋白分子質(zhì)量的對數(shù)間的線性關(guān)系［15］.但由于SDS-PAGE檢測簡便快捷，所以仍是目前研究分析卵黃蛋白亞基分子質(zhì)量的首選.

研究甲殼動物卵黃蛋白，最終目的是要了解其合成積累機理，對卵黃蛋白的純化鑒定則是這一工作的前提.通過分離純化卵黃蛋白來制備其特異性抗體，由于卵黃蛋白與其前體卵黃蛋白原具有免疫同一性，該抗體可用以檢測卵黃蛋白原的發(fā)生以及卵黃蛋白的積累部位，探討其合成機理，了解相關(guān)激素的內(nèi)分泌調(diào)控機制，為在養(yǎng)殖過程中實現(xiàn)親本促熟提供科學依據(jù).

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Purification and Identification of Vitellin inNeocaridinadenticulatasinensis

MU Shu-mei1，YANG Yan1，2，SUN Shi-jie1，KANG Xian-jiang1
（1.College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China；2.Center of Biological Products，North China Pharmaceutical Group Corporation（NCPC）GeneTech Biotechnology Development Co.Ltd.，Shijiazhuang 050035，China）

In order to investigate the properties of vitellin（Vn），Vn from the matured ovaries ofNeocaridinadenticulatasinensiswas purified by electroelution and characterized by native polyacrylamide gel electrophoresis（PAGE），gradient PAGE and SDS-PAGE.The results indicated that Vn was a lipoglycoprotein with a molecular mass of 434ku and contained three major subunits（108，89，78ku）.

Neocaridinadenticulatasinensis；vitellin；electroelution；purification；identification

Q 959.223

A

1000-1565（2011）06-0638-05

2011-04-10

河北省自然科學基金資助項目（C2011201028）；保定市科學研究與發(fā)展計劃項目（10ZN008）

穆淑梅（1972-），女，河北曲陽人，河北大學講師，主要從事動物生殖毒理學研究.

康現(xiàn)江（1964-），男，河北邯鄲人，河北大學教授，博士生導師，主要從事動物生殖生物學方面的研究.

E-mail：xjkang＠hbu.edu.cn

趙藏賞）