異基因造血干細胞移植中同種異體NK細胞的臨床應用及研究進展

薛同圓，何穎芝，陸 藝，張佳佳，張軒煜，忻勇杰（綜述），李玉華※（審校）

（1.南方醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院，廣州 510515;2.南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院血液科，廣州 510282;3.南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學學院，廣州 510515）

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是成人白血病的主要類型。AML患者化療或移植后體內仍殘存少量白血病干細胞，成為復發(fā)的根源。而近年來已有研究證明，同種異體自然殺傷（natural killer，NK）細胞輸注治療能有效降低AML患者的復發(fā)率，并提高其生存質量，這使同種異體NK細胞成為國內外近來研究的熱點。在異基因造血干細胞移植（allo-hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）中，通過殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR）-人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）錯配原理，促使供者NK細胞產生對受者細胞的同種異體反應性，并介導對白血病干細胞的殺傷作用。這將指導造血干細胞合適配型供者的選擇以及淋巴輸注治療，降低移植后微小殘留病的復發(fā)，提高長期生存率，為改善AML患者生存質量帶來曙光。

1 KIR的結構及KIR與HLAⅠ類分子的結合

KIR基因位于染色體19q13.4，它含有2 個（KIR2D）或3個（KIR3D）胞外 Ig樣結構域。形態(tài)上，可分為介導活化性信號的短（S）胞質內尾端（KIR2DS和 KIR3DS）和介導抑制性信號的長（L）胞質內尾端 （KIR2DL 和 KIR3DL）［1］。目前KIR基因家族包括19個基因型，其中抑制型為KIR2DL1-3、KIR3DL1-3，活化型為 KIR2DS1-5、KIR3DS1 和KIR2DL4［2］。L 型胞質區(qū)含有1～2個免疫受體酪氨酸抑制基序，可趨化SHP-1，介導抑制性信號;S型胞質區(qū)不含免疫受體酪氨酸抑制基序，其跨膜區(qū)含帶正電荷的天冬氨酸殘基，可以結合凋亡相關蛋白，介導活化性信號［3］。

KIR可與多種HLAⅠ類分子結合。HLA-C被KIR2DL1、KIR2DL2和 KIR2DL3識別，HLA-B被KIR3DL1識別，HLA-A被 KIR3DL識別，HLA-G被KIR2DL4識別［4］。其中最主要的配體為 HLA-C位點編碼的分子。KIR2DL2/3識別C1表位，KIR2DL1識別C2表位［5］。類似HLA-B位點編碼的所有分子中，僅Bw4表位是KIR3DL1的配體。

2 allo-HSCT中NK細胞的同種異體反應性

在allo-HSCT中，如果受者細胞不表達供者HLAⅠ類分子，則供者NK細胞的殺傷作用不能被抑制，它們就可能通過KIR-HLA錯配來促使其產生對受者細胞的同種異體反應性，并介導靶細胞（腫瘤細胞、病毒感染細胞等）的殺傷作用［6］。其中，同種異體NK細胞介導移植物抗白血?。╣raft-versus-leukemia，GvL）效應，并降低移植物抗宿主?。╣raft-versushost disease，GvHD）發(fā)生率。

研究發(fā)現(xiàn)，在allo-HSCT中，供者同種異體NK細胞清除受者白血病細胞，即GvL效應［7］。對此可能的解釋是HLA錯配移植時，灌注大量（比HLA配型移植時多5～20倍）CD34+造血干細胞，可能會提供一個供者類型主導的骨髓微環(huán)境。在這種條件下，受者 NK 細胞被“許可/馴化”［8］（licensed/educated，即指成熟期NK細胞識別自身HLAⅠ類分子以獲得全部效應功能），這將最終導致供、受者NK細胞都具有同種異體反應性，特異性殺傷受者靶細胞（“missingself”識別）。這不僅永久清除了受者淋巴造血細胞，也立即破壞/清除了骨髓基質細胞［9］。因此，NK細胞在骨髓微環(huán)境中成熟。體外實驗證實，同種異體NK細胞可在allo-HSCT中介導GvL效應，特異性殺傷AML細胞，從而控制其惡化［10］。

同時，同種異體NK細胞也可以清除抗原遞呈細胞，使抗原無法遞呈給T細胞，從而降低GvHD的發(fā)生率。Ruggeri等［11］獲得小鼠體內的直接證據(jù)指出，輸注同種異體NK細胞并不能引發(fā)GvHD，而輸注同種異體T細胞則能引起嚴重的GvHD，導致對小鼠組織細胞的殺傷。Willemze等［12］證明了GvHD方向的KIR錯配嚴重減少了疾病惡化概率，并提高了白血病患者（尤其是AML患者）生存率。

同種異體NK細胞通過殺傷受者白血病細胞（GvL效應）改善移植物植入性，通過清除受者抗原遞呈細胞降低GvHD的發(fā)生率。因此，與同種異體T細胞不同，在allo-HSCT中同種異體NK細胞介導的GvL效應和降低的GvHD發(fā)生率使其特別適合移植。

3 allo-HSCT中同種異體NK細胞的臨床應用

3.1 選擇最佳同種異體NK細胞供者 體內研究、鼠類模型和臨床試驗的聯(lián)合證據(jù)指出，NK細胞介導異源性反應需要任意一種KIR配體（C1、C2、Bw4）GvHD 方向錯配的“missing-self”識別［12］。在 allo-HSCT時，同種異體 NK細胞供者應以 HLA分型（HLA-C1型、HLA-C2型、HLA-Bw4型）為選擇的基礎，受者至少不能表達供者KIR配體的一個等位基因組。并且供者范圍的尋找也正不斷擴大，從家族直系親屬（父母和同胞）至其他成員，尋找合適供者的可能性超過60%［13-15］。

然而，近來研究已經對這種“missing-self”識別機制作出細微改良。在一個KIR3DL1-Bw4相互作用的研究中，Moretta等［16］已經表明，KIR受體、配體的多態(tài)性都影響抑制性相互作用的有效性，從而影響抑制性信號，當KIR3DL1識別HLA-Bw4等位基因大量位點（除B*1301、1302）和一些Bw4陽性的HLA-A等位基因（A*2301、2402、3201）產生強烈的抑制性信號時，其他等位基因僅提供微弱的抑制性信號，如HLA-B*1301和 HLA-A* 2501。同時，表達KIR3DL1的NK細胞克隆頻率也因此受到影響［14］。

綜上所述，最佳供者的選擇基于NK細胞同種異體反應性程度的評估。近來研究表明，KIR受體、配體的多態(tài)性通過影響抑制性相互作用，而影響抑制性信號和表達KIR不同亞型的NK細胞克隆頻率。大量供者NK細胞克隆和對受者靶細胞的細胞毒作用檢測，可以發(fā)現(xiàn)最佳同種異體NK細胞供者［15］。

3.2 同種異體NK細胞治療白血病 Moretta等［16］研究表明，對抗白血病細胞的同種異體反應性由抑制性和活化性KIR傳遞的整合信號調節(jié)。近年來研究表明［17，18］，C1、C2 表位和它們的 KIR2DL 抑制性受體相互作用，KIR2DL1特異性識別 C2表位，KIR2DL2/3特異性識別C1表位。為此，研究者作了以下對比試驗［19］:①KIR2DL1+同種異體NK細胞殺傷C1/C1+白血病細胞，而不殺傷C2/C2+白血病細胞。②KIR2DL1+和KIR2DL2/3+共表達的同種異體NK細胞對C1/C1+和C2/C2+白血病細胞都不殺傷。③KIR2DL2/3+同種異體NK細胞微弱殺傷C2/C2+白血病細胞，而不殺傷C1/C1+白血病細胞。④KIR2DL2/3+NK細胞只要共表達KIR2DS1，就能殺傷C2/C2+白血病細胞，而不殺傷C1/C1+白血病細胞。在C1錯配的allo-HSCT中，KIR2DL2/3+NK細胞微弱殺傷C2/C2+白血病細胞。這說明了KIR2D2/3不僅識別C1表位，也能微弱識別C2表位。

Chewning等［20］報道，缺失 KIR2DS1供者的 NK細胞中，對C2表位“missing-self”的同種異體反應性應答很少發(fā)現(xiàn)。這表明KIR2DS1能識別C2表位并作為活化性受體殺傷靶細胞。在C1錯配（同種異體NK細胞亞群為KIR2DL2/3+）的allo-HSCT中，接受KIR2DS1+供者半相合allo-HSCT的4例患者都得以存活并處于完全緩和狀態(tài)。然而，接受缺失KIR2DS1供者半相合allo-HSCT的4例患者中有3例發(fā)生致命惡化［18］。這些數(shù)據(jù)強有力的支持了KIR2DS1介導白血病細胞殺傷的大量臨床試驗。

然而，另一些研究表明，KIR2DL2/3+同種異體NK細胞亞群極為稀少，僅見于C1純合的個體中（該個體缺少C2表位）［9］。但是，由于受者的HLAⅠ類分子必包含C1表位，使得C1純合的供者NK細胞無法具有對受者細胞的同種異體反應性，因而無法識別“missing-self”，更不能殺傷靶細胞。然而，擁有所有三種KIR配體（HLA-C1、C2和Bw4）的受者，也許會從C1純合的KIR2DS1+同種異體NK細胞供者的半相合移植中受益［21］。但這種可能性還需要深入研究，因為它對成人AML半相合移植并不適用。在分析供者NK細胞對抗缺失C1表位靶細胞（PHA母細胞或AML細胞）的同種異體反應性時，同種異體NK細胞克隆頻率在KIR2DS1-negative和KIR2DS1-positive供者中無顯著性差異，且它們的殺傷效率一致。

抑制性作用有賴于NK細胞/靶細胞相互作用產生的活化信號強度。由于KIR2DL2/3與C2表位的低親和性而產生微弱的抑制作用，使其僅微弱殺傷靶細胞。而在KIR2DS1與C2表位強活化信號的同時作用下，同種異體NK細胞即高效殺傷靶細胞。

AML是成人白血病的主要類型，近年來研究也表明［22］，同種異體 NK細胞輸注治療能有效降低AML患者的復發(fā)率并提高其生存質量。牛新清［23］研究發(fā)現(xiàn)，人AML細胞株KGlA可能是研究白血病干細胞很好的細胞模型，因為這些KGlA細胞表達CD34而不表達CD38。并且，其通過流式細胞儀檢測得出KG1A細胞表面存在的主要為KIR2DL1配體，推測KIR2DL1可能為NK表面導致其對KG1A低殺傷的主要抑制性受體，但國內尚未有研究證明。

4 結語

增強機體免疫細胞殺傷白血病效應成為研究的熱點。而NK細胞是機體天然免疫的主要承擔者，具有天然殺傷腫瘤細胞的能力。通過KIR-HLA錯配原理，增強NK細胞殺傷白血病細胞效應，有助于選擇同種異體反應性造血干細胞移植供者的合適配型，更好地發(fā)揮NK細胞天然免疫的能力，降低白血病的瘤負荷，減少復發(fā)概率，改善預后和患者的生存質量。

［1］Benjamin JE，Gill S，Negrin RS.Biology and clinical effects of natural killer cells in allogeneic transplantation［J］.Curr Opin Oncol，2010，22（2）:130-137.

［2］Biassoni R，Ugolotti E，De Maria A.Comparative analysis of NK-cell receptor expression and function across primate species:perspective on antiviral defenses［J］.Self Nonself，2010，1（2）:103-113.

［3］Beziat V，Descours B，Parizot C，et al.NK cell terminal differentiation:correlated stepwise decrease of NKG2A and acquisition of KIRs［J］.PLoS One，2010，5（8）:e11966.

［4］Abi-Rached L，Moesta AK，Rajalingam R，et al.Human-specific evolution and adaptation led to major qualitative differences in the variable receptors of human and chimpanzee natural killer cells［J］.PLoS Genet，2010，6（11）:e1001192.

［5］Fourmentraux-Neves E，Jalil A，Da RS，et al.Two opposite signaling outputs are driven by the KIR2DL1 receptor in human CD4+T cells［J］.Blood，2008，112（6）:2381-2389.

［6］Langenkamp U，Siegler U，Jorger S，et al.Human acute myeloid leukemia CD34+CD38－stem cells are susceptible to allorecognition and lysis by single KIR-expressing natural killer cells［J］.Haematologica，2009，94（11）:1590-1594.

［7］Merindol N，Charrier E，Duval M，et al.Complementary and contrasting roles of NK cells and T cells in pediatric umbilical cord blood transplantation［J］.J Leukoc Biol，2011.［Epub ahead of print］

［8］Sun JC.Re-educating natural killer cells［J］.J Exp Med，2010，207（10）:2049-2052.

［9］Velardi A，Ruggeri L，Mancusi A，et al.Natural killer cell allorecognition of missing self in allogeneic hematopoietic transplantation:a tool for immunotherapy of leukemia［J］.Curr Opin Immunol，2009，21（5）:525-530.

［10］Voskens CJ，Watanabe R，Rollins S，et al.Ex-vivo expanded human NK cells express activating receptors that mediate cytotoxicity of allogeneic and autologous cancer cell lines by direct recognition and antibody directed cellular cytotoxicity［J］.J Exp Clin Cancer Res，2010，29:134.

［11］Ruggeri L，Capanni M，Urbani E，et al.Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismatched hematopoietic transplants［J］.Science，2002，295（5562）:2097-2100.

［12］Willemze R，Rodrigues CA，Labopin M，et al.KIR-ligand incompatibility in the graft-versus-host direction improves outcomes after umbilical cord blood transplantation for acute leukemia［J］.Leukemia，2009，23（3）:492-500.

［13］Gill S，Olson JA，Negrin RS.Natural killer cells in allogeneic transplantation:effect on engraftment，graft-versus-tumor，and graft-versus-host responses［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2009，15（7）:765-776.

［14］Stern M，Ruggeri L，Capanni M，et al.Human leukocyte antigens A23，A24，and A32 but not A25 are ligands for KIR3DL1［J］.Blood，2008，112（3）:708-710.

［15］Nguyen S，Beziat V，Norol F，et al.Infusion of allogeneic natural killer cells in a patient with acute myeloid leukemia in relapse after haploidentical hematopoietic stem cell transplantation［J］.Transfusion，2011.［Epub ahead of print］

［16］Moretta A，Locatelli F，Moretta L.Human NK cells:from HLA class I-specific killer Ig-like receptors to the therapy of acute leukemias［J］.Immunol Rev，2008，224:58-69.

［17］Moesta AK，Norman PJ，Yawata M，et al.Synergistic polymorphism at two positions distal to the ligand-binding site makes KIR2DL2 a stronger receptor for HLA-C than KIR2DL3［J］.J Immunol，2008，180（6）:3969-3979.

［18］Pende D，Marcenaro S，F(xiàn)alco M，et al.Anti-leukemia activity of alloreactive NK cells in KIR ligand-mismatched haploidentical HSCT for pediatric patients:evaluation of the functional role of activating KIR and redefinition of inhibitory KIR specificity［J］.Blood，2009，113（13）:3119-3129.

［19］Moretta A，Pende D，Locatelli F，et al.Activating and inhibitory killer immunoglobulin-like receptors（KIR）in haploidentical haemopoietic stem cell transplantation to cure high-risk leukaemias［J］.Clin Exp Immunol，2009，157（3）:325-331.

［20］Chewning JH，Gudme CN，Hsu KC，et al.KIR2DS1-positive NK cells mediate alloresponse against the C2 HLA-KIR ligand group in vitro［J］.J Immunol，2007，179（2）:854-868.

［21］Ruggeri L，Mancusi A，Capanni M，et al.Donor natural killer cell allorecognition of missing self in haploidentical hematopoietic transplantation for acute myeloid leukemia:challenging its predictive value［J］.Blood，2007，110（1）:433-440.

［22］Parmar S，F(xiàn)ernandez-Vina M，de Lima M.Novel transplant strategies for generating graft-versus-leukemia effect in acute myeloid leukemia［J］.Curr Opin Hematol，2011，18（2）:98-104.

［23］牛新清.調節(jié)急性髓系白血病干細胞對同種異體NK細胞殺傷的敏感性［D］.廣州:南方醫(yī)科大學，2008.