乳酸桿菌及其體外表達(dá)系統(tǒng)在臨床中的應(yīng)用及其前景

王青元，周 穎（綜述），凌 斌（審校）

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院婦產(chǎn)科分子實(shí)驗(yàn)室，安徽省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230001）

乳酸桿菌，因發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸而命名。該菌廣泛存在，嗜酸性、兼性厭氧，生存最適環(huán)境為pH 5.5～6.0，但是 pH 3.0～4.5 時(shí)仍能生存，在無(wú)芽胞桿菌中其耐酸力最強(qiáng)。過氧化氫酶試驗(yàn)和聯(lián)苯胺試驗(yàn)均為陰性，吲哚試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)均呈陰性。作為益生菌，乳酸桿菌在日常生活及臨床應(yīng)用較為廣泛，如生產(chǎn)酸奶、治療陰道疾病、生產(chǎn)疫苗等?，F(xiàn)就乳酸桿菌及其體外表達(dá)系統(tǒng)在臨床中的應(yīng)用綜述如下。

1 乳酸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)

1.1 培養(yǎng)條件 乳酸桿菌，營(yíng)養(yǎng)要求嚴(yán)格，除碳水化合物外，需要多種氨基酸、維生素、肽等。目前實(shí)驗(yàn)室一般采用的培養(yǎng)基有:MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基和番茄汁培養(yǎng)基，選擇在含有5%CO2的厭氧罐中發(fā)酵式培養(yǎng)。

1.2 表達(dá)質(zhì)粒 大多數(shù)乳酸桿菌均含有質(zhì)粒，少數(shù)還含有多種質(zhì)粒且乳酸桿菌質(zhì)粒多具有隱蔽性、遺傳穩(wěn)定性、含抗生素基因及小型質(zhì)粒拷貝數(shù)高等特點(diǎn)。乳酸桿菌雖然是食品級(jí)安全菌，但并不是所有的乳酸桿菌及其質(zhì)粒都適合體外表達(dá)蛋白及在臨床中應(yīng)用。目前分離及改造的乳酸桿菌質(zhì)粒按安全范圍分為食品級(jí)和非食品級(jí)，按照宿主范圍分廣宿主和窄宿主兩種［1］。食品級(jí)、宿主范圍較窄的乳酸桿菌質(zhì)粒更適合在醫(yī)學(xué)中應(yīng)用，如pSUW611、pSUW711、pNZ8048、pFMN30［2-4］等。

1.3 誘導(dǎo)表達(dá)及啟動(dòng)子隨著乳酸桿菌分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)的發(fā)展，已分離出了乳酸桿菌的各種表達(dá)調(diào)控元件，對(duì)乳酸桿菌基因轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控及蛋白質(zhì)分泌機(jī)制有了進(jìn)一步的了解。研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌質(zhì)粒中普遍存在兩種調(diào)控序列:一種是與基因復(fù)制起始相關(guān)的序列，另一種是控制質(zhì)?？截悢?shù)和不相容性的DNA序列。質(zhì)粒的拷貝數(shù)是由DNA非編碼序列中的重復(fù)序列和反轉(zhuǎn)錄RNA來控制的。與基因復(fù)制起始相關(guān)的序列分兩類:一類是編碼蛋白的開放閱讀框架，在乳酸桿菌中與質(zhì)粒復(fù)制相關(guān)的開放閱讀框架之間存在同源性;另一類是與調(diào)控有關(guān)的非編碼序列，包括復(fù)制相關(guān)蛋白作用的靶序列、正-負(fù)向復(fù)制起始點(diǎn)、缺失位點(diǎn)、啟動(dòng)子等復(fù)制調(diào)控元件［1，5］。其中乳酸桿菌的啟動(dòng)子對(duì)乳酸桿菌具有高度的選擇性，故在乳酸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，很少使用外源性啟動(dòng)子，目前已成功用于表達(dá)外源性蛋白的啟動(dòng)子有 lacA、lacR、lacF、T7、xylA、lacS、nisA、nisZ、nisF、usp等，這些啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物都是食品級(jí)的，如乳糖、木糖和乳球菌素等，易于構(gòu)成食品級(jí)乳酸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，提高乳酸桿菌工程菌株的安全性。

2 乳酸桿菌在疾病預(yù)防和治療中的應(yīng)用

乳酸桿菌是在人體內(nèi)胃腸道和泌尿生殖道中定植的正常菌群，在疾病預(yù)防、治療以及抗衰老、抗腫瘤等方面發(fā)揮重要的生理功能。

2.1 預(yù)防疾病

2.1.1 調(diào)節(jié)機(jī)體微生態(tài)平衡 乳酸桿菌作為胃腸道和泌尿生殖道中的優(yōu)勢(shì)菌群通過黏附定植和競(jìng)爭(zhēng)性抑制及產(chǎn)生殺菌性物質(zhì)（如乳酸、過氧化氫、細(xì)菌素、生物表面活性物質(zhì)等）等維持機(jī)體內(nèi)菌群的種類、數(shù)量及比例協(xié)調(diào)，從而維持機(jī)體微生態(tài)平衡。

2.1.2 免疫功能 乳酸桿菌能夠促進(jìn)體液免疫和細(xì)胞免疫的形成，激活免疫系統(tǒng)。對(duì)于非特異性免疫系統(tǒng)，乳酸桿菌主要通過增強(qiáng)黏膜屏障功能、增強(qiáng)體內(nèi)吞噬細(xì)胞的吞噬功能、增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的殺傷作用、刺激機(jī)體產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素2、干擾素 γ、白細(xì)胞介素12、干擾素 α、白細(xì)胞介素10等且不同的乳酸桿菌菌株產(chǎn)生的細(xì)胞因子不盡相同［6］;對(duì)于特異性免疫系統(tǒng)，乳酸桿菌能夠增強(qiáng)T細(xì)胞的分化、增殖能力，提高T細(xì)胞的數(shù)量。同時(shí)能夠刺激特異性免疫應(yīng)答，如增加黏膜表面和血清中IgA和IgM、IgG水平以強(qiáng)化體液免疫，促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞的增殖和成熟，加強(qiáng)細(xì)胞免疫。乳酸桿菌還能減少特異性皮炎的發(fā)生，減輕變態(tài)反應(yīng)程度、調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡。此效應(yīng)是通過菌群基因組DNA刺激外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的，且與乳酸桿菌進(jìn)入機(jī)體的劑量有關(guān)［7］。

2.2 抗感染作用 乳酸桿菌在治療胃腸道、呼吸道、泌尿生殖道的感染性疾病中發(fā)揮重要作用。創(chuàng)傷、感染患者機(jī)體內(nèi)大多存在胃腸道過度炎性反應(yīng)，嚴(yán)重者可引起膿毒血癥和多器官功能障礙。Chu等［8］研究顯示，乳酸桿菌能減輕腸道炎性反應(yīng)，降低腸道內(nèi)毒素血癥。Chiba等［9］實(shí)驗(yàn)證實(shí)，給予大鼠活性乳酸桿菌，增強(qiáng)細(xì)胞整體免疫功能，同時(shí)使鼻腔內(nèi)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生干擾素γ和腫瘤壞死因子α增多，有利于機(jī)體清除流感病毒。Graver等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧環(huán)境中生長(zhǎng)的乳酸桿菌主要通過產(chǎn)酸來抵抗淋病奈瑟菌的感染，并不產(chǎn)生過氧化氫。研究發(fā)現(xiàn)，患有下呼吸道感染的兒童70%伴有腸道菌群紊亂，表現(xiàn)在乳酸桿菌優(yōu)勢(shì)水平下降，腸球菌增殖，尤其并發(fā)肺炎的患兒［11］。正常女性陰道內(nèi)含有多種細(xì)菌，其中乳酸桿菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，維持菌群平衡。一旦乳酸桿菌的優(yōu)勢(shì)地位丟失，各種致病菌大量繁殖是細(xì)菌性陰道炎、滴蟲性陰道炎、霉菌性陰道炎發(fā)生和復(fù)發(fā)的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，陰道炎的患者口服或陰道局部應(yīng)用乳酸桿菌制劑有助于改變陰道內(nèi)環(huán)境、降低并發(fā)癥和復(fù)發(fā)率。

2.3 抗衰老作用 乳酸桿菌能減少機(jī)體有毒產(chǎn)物（組胺、酪氨、腐胺、硫化氫、吲哚、亞硝酸鹽和酚類等）的產(chǎn)生與吸收［12］，有利于臟器功能的正常發(fā)揮及衰老進(jìn)程的延緩。乳酸桿菌還可有效參與機(jī)體抗氧化反應(yīng)，提高過氧化物酶和還原型谷胱甘肽的水平。Van Nieuwenhove［13］等將乳酸桿菌應(yīng)用于肝損傷小鼠，探討其對(duì)肝內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及自然殺傷細(xì)胞活性的影響。結(jié)果顯示，乳酸桿菌能提高脾臟內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性及還原性谷胱甘肽水平，降低丙二醛水平。

2.4 抗腫瘤作用 乳酸桿菌在維持機(jī)體菌群平衡中起重要作用，如果乳酸桿菌的數(shù)量或者活性降低會(huì)導(dǎo)致機(jī)體微生態(tài)平衡被打破，致病菌群會(huì)大量繁殖。致病菌產(chǎn)生的代謝物質(zhì)會(huì)促使機(jī)體內(nèi)的癌前體物質(zhì)向致癌物質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而誘發(fā)癌變。乳酸桿菌能夠恢復(fù)腸道菌群平衡，拮抗腸道中病原菌生長(zhǎng)，使細(xì)菌酶的產(chǎn)生及活性降低，還可結(jié)合致癌物質(zhì)隨糞便排出，減少了其形成、活化及滯留的機(jī)會(huì)。研究報(bào)道乳酸桿菌能夠防止幽門螺桿菌的感染并有一定的治療作用，因而間接地降低了胃癌的發(fā)病率。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，乳酸桿菌能夠抑制Lewis肺癌、ethA纖維瘤、B16黑素瘤、膀胱癌、淋巴瘤等多種腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)［14］。

乳酸桿菌可激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，特別是巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。其中巨噬細(xì)胞抗瘤作用具有重要意義，巨噬細(xì)胞可能是通過內(nèi)吞和分泌腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素2等效應(yīng)因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗瘤效應(yīng)。乳酸桿菌表面的肽聚糖、脂磷壁酸以及源于細(xì)菌DNA中的大量非甲基化CpG二核苷酸為核心的CpG基序可直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化和凋亡。CpG基序可活化巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞，從而具有免疫調(diào)節(jié)活性。細(xì)菌核酸中含有CpG基序的部分還通過與人體細(xì)胞表面特異性受體——Toll樣受體家族中的Toll樣受體9（Toll-like receptor，TLR9）相結(jié)合，激活機(jī)體的天然免疫反應(yīng)［15-17］。乳酸桿菌基因組AT核苷酸也可以通過與TLR9結(jié)合來增強(qiáng)TH1型免疫反應(yīng)，上調(diào)抗腫瘤免疫反應(yīng)水平［18］。

乳酸桿菌細(xì)胞壁中的肽聚糖和脂磷壁酸是NO合成酶的誘導(dǎo)劑，它們能刺激巨噬細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞產(chǎn)生NO。NO是生物體重要的信號(hào)分子和活化巨噬細(xì)胞的效應(yīng)分子，可通過以下途徑發(fā)揮抗腫瘤作用:①與腫瘤細(xì)胞代謝關(guān)鍵酶的活性部位FeS基結(jié)合，形成鐵亞硝基復(fù)合物，使酶失活，繼而引起腫瘤細(xì)胞能量代謝障礙;②可滅活DNA合成的限速酶——核糖核酸酶，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖;③可使核酸亞硝基化，導(dǎo)致DNA斷裂，最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;④NO與氧結(jié)合，形成強(qiáng)有力的殺傷細(xì)胞的羥自由基和 NO2［19］。Horinaka 等［20］發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌能誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生TRAIL（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand），同時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌激活自然殺傷細(xì)胞對(duì)前列腺癌的殺傷作用是通過誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生TRAIL的途徑實(shí)現(xiàn)的。

實(shí)體瘤具有低氧代謝區(qū)，乳酸桿菌屬于兼性厭氧菌具有趨低氧代謝特性，對(duì)實(shí)體瘤有良好的靶向性，并且能夠通過產(chǎn)生過氧化氫和激肽酶發(fā)揮抗實(shí)體瘤作用。因此，某些乳酸桿菌可用于腫瘤治療，或作為腫瘤基因治療的轉(zhuǎn)移載體在腫瘤低氧區(qū)域選擇性富集而達(dá)到基因治療目的。

3 基因工程乳酸桿菌的臨床應(yīng)用

由于乳酸桿菌在改善胃腸道功能、維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、提高機(jī)體免疫力方面的突出功用，近年來，以乳酸桿菌為宿主菌的基因治療、重組蛋白表達(dá)和疫苗制備等方面的研究受到國(guó)內(nèi)外科研工作者的高度重視。

3.1 基因治療 美國(guó)和海外研究人員［21］利用人體陰道內(nèi)生菌開發(fā)出一種活性、外用殺菌劑，可以誘導(dǎo)1型人體免疫缺陷病毒蛋白抑制劑的生成并最終防止該病毒的傳播。在這項(xiàng)研究中，研究人員利用從人體陰道分離出的詹氏乳酸桿菌，通過工程化改造，使其可以產(chǎn)生對(duì)抗1型人體免疫缺陷病毒受體蛋白的抗1型人體免疫缺陷病毒蛋白質(zhì)RANTES和CIC5 RANTES。兩種RANTES蛋白質(zhì)變體均可抑制1型人體免疫缺陷病毒感染，并對(duì)多種1型人體免疫缺陷病毒遺傳亞型有顯著的抑制作用。

3.2 細(xì)胞因子等功能蛋白的體外表達(dá) 利用現(xiàn)代基因工程和生物工程技術(shù)，以乳酸桿菌為載體或宿主菌表達(dá)一些特定功能的蛋白或多肽，可賦予雙歧桿菌更多的醫(yī)用價(jià)值。目前，國(guó)內(nèi)外很多實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)掌握了乳酸桿菌體外表達(dá)融合蛋白的技術(shù)并成功表達(dá)了很多功能蛋白。Miyoshi等［22］通過基因工程方法剔除了乳酸桿菌細(xì)胞外管家蛋白酶HtrA基因，從而使異源蛋白在乳酸桿菌中大量而穩(wěn)定地表達(dá)。

3.3 疫苗 理想的黏膜免疫疫苗可以促進(jìn)抗原和免疫系統(tǒng)之間的有效接觸、刺激體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)、在單劑量免疫以后產(chǎn)生長(zhǎng)期的免疫保護(hù)作用，并且穩(wěn)定、無(wú)毒性。乳酸桿菌因良好的安全性和免疫佐劑作用，可以作為一種良好的疫苗載體。與采用腺病毒、沙門菌和大腸埃希菌等致病菌為載體的疫苗相比，以乳酸桿菌為載體的疫苗用藥更加安全，適宜多次重復(fù)免疫的要求，更適應(yīng)未來疫苗的發(fā)展趨勢(shì)。用乳酸桿菌作為疫苗載體可使口服的乳酸桿菌在體內(nèi)刺激產(chǎn)生黏膜及全身免疫反應(yīng)，促進(jìn)IgA的分泌，提高免疫活性因子的分泌。Aires等［23］利用干酪乳酸桿菌的乳糖操縱子表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了人乳頭狀瘤病毒16的主要衣殼蛋白L1，并通過電子顯微鏡證實(shí)表達(dá)的衣殼蛋白L1能夠自我組裝進(jìn)入VLPs（virus-like particles）細(xì)胞內(nèi)。同時(shí)，ELISA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了小鼠皮下注射乳酸桿菌表達(dá)的衣殼蛋白L1后的小鼠血清中含有人乳頭狀瘤病毒16 L1 VLPs的抗體，為進(jìn)一步開發(fā)研究宮頸癌的黏膜預(yù)防疫苗奠定基礎(chǔ)。

4 展望

乳酸桿菌是益生菌的重要組成成員，在人體胃腸道和泌尿生殖道中以優(yōu)勢(shì)菌群廣泛存在，其本身及其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，如短鏈脂肪酸、過氧化氫、細(xì)菌素、蛋白質(zhì)和各種酶類等，在機(jī)體代謝、免疫調(diào)節(jié)等方面起著極為重要的作用。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)蓬勃發(fā)展，人們已經(jīng)不滿足于僅開發(fā)乳酸桿菌自身的食品及臨床應(yīng)用價(jià)值。近幾年，乳酸桿菌因具有食品級(jí)安全性和局部黏膜定植性及免疫佐劑等特殊性，被廣泛應(yīng)用于疫苗載體的研究，不斷開發(fā)和衍生出了許多更適合功能蛋白表達(dá)、分泌和功能發(fā)揮的菌株和載體質(zhì)粒。但是，目前這方面的成果還局限于科學(xué)研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，有待于大量的臨床資料驗(yàn)證。伴隨乳酸桿菌工程菌研究技術(shù)的不斷成熟，科研人員已經(jīng)將乳酸桿菌研究的熱點(diǎn)轉(zhuǎn)移到某些重要細(xì)胞因子和功能蛋白的融合表達(dá)，試圖借助乳酸桿菌良好的靶向定植和免疫佐劑功能，將某些重要的細(xì)胞因子和功能蛋白大量表達(dá)在病灶局部，以期發(fā)揮顯著的治療作用。目前，針對(duì)乳酸桿菌的研究，已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，但也有很多亟待研究的地方。①乳酸桿菌自身如何發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)、抗感染、抗腫瘤等作用的分子機(jī)制并不清晰。②乳酸桿菌制劑的質(zhì)量、應(yīng)用于臨床的劑量和時(shí)機(jī)以及后期疾病轉(zhuǎn)歸等缺乏大量病例資料統(tǒng)計(jì)、歸納。③乳酸桿菌作為原核生物表達(dá)的蛋白多為胞內(nèi)蛋白，如何將重組蛋白分泌到胞外且具備人體內(nèi)正常的折疊、修飾和生物學(xué)功能等需要后期大量的研究。④乳酸桿菌作為疫苗、重要細(xì)胞因子和功能蛋白的載體時(shí)，一旦這些蛋白進(jìn)入人體細(xì)胞或釋放到外環(huán)境中，導(dǎo)致的結(jié)果尚不明確。隨著乳酸桿菌基因工程表達(dá)系統(tǒng)的完善及深入研究，乳酸桿菌在未來的食品生產(chǎn)和臨床應(yīng)用中將展示出廣闊的應(yīng)用前景。

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