感覺(jué)神經(jīng)末梢形態(tài)學(xué)研究方法及其在軀干和四肢軟組織中的研究進(jìn)展

王永志(綜述)，李 麗(審校)

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院中醫(yī)科，北京100050)

神經(jīng)形態(tài)知識(shí)的逐步深入，有賴(lài)于研究方法的不斷發(fā)展與改進(jìn)，建立在中樞神經(jīng)系統(tǒng)上的銀染法、免疫組化法和神經(jīng)順行示蹤法等，同樣適用于針對(duì)感覺(jué)神經(jīng)末梢(sensory nerve ending，SNE)的研究。這樣，在SNE形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上，研究者可以對(duì)軀體神經(jīng)干、神經(jīng)分支在其走行過(guò)程中，由于某些原因受到慢性損傷引起的局部疼痛、壓痛、感覺(jué)異常等系列神經(jīng)功能障礙進(jìn)行闡釋。

1 SNE分類(lèi)

神經(jīng)末梢一般是指周?chē)窠?jīng)纖維軸突的終末，它分布于全身各種組織和器官中。神經(jīng)末梢包括接受體表和內(nèi)臟感覺(jué)傳入的SNE以及支配肌肉或腺體等效應(yīng)器官的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢。臨床上各種感覺(jué)的產(chǎn)生均來(lái)自于SNE，其形態(tài)結(jié)構(gòu)不同，種類(lèi)甚多，根據(jù)形態(tài)學(xué)觀點(diǎn)可將其歸結(jié)為游離的神經(jīng)末稍和有被囊的神經(jīng)末稍兩種［1］。

1.1 游離神經(jīng)末稍 構(gòu)成游離神經(jīng)末稍的多是Aδ類(lèi)及c類(lèi)神經(jīng)纖維。真皮內(nèi)的神經(jīng)纖維于不同深度反復(fù)分支，并失去髓鞘，形成裸露的軸突末稍，分布在表皮細(xì)胞之間，幾乎抵達(dá)角質(zhì)層。每個(gè)末稍分布于表皮1至數(shù)毫米范圍，彼此重疊交錯(cuò)，使皮膚具有很高的敏感性。筋膜、韌帶、骨膜、腦膜、肌鍵、關(guān)節(jié)囊等處也有游離神經(jīng)末稍，一般認(rèn)為它們大都是傷害感受器，各種不同性質(zhì)的刺激達(dá)到一定強(qiáng)度，就成為傷害性刺激，都能引起痛覺(jué)。目前研究認(rèn)為，這種與傷害刺激有關(guān)的游離神經(jīng)末稍即是痛覺(jué)感受器。痛覺(jué)感受器在很多情況下是一種化學(xué)感受器，當(dāng)組織受到損傷時(shí)，感受器周?chē)h(huán)境的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，例如，損傷組織釋放出組胺、5-羥色胺、緩激肽、前列腺素和鉀離子等各種致痛物質(zhì)，作用于游離神經(jīng)末稍，達(dá)到傷害性刺激的程度，從而引起傳入沖動(dòng)，進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起痛覺(jué)。

1.2 有被囊神經(jīng)末稍 此類(lèi)神經(jīng)末梢包以結(jié)締組織成分組成被囊，種類(lèi)很多，大小不一。它們大都有快適應(yīng)的特點(diǎn)。目前研究比較多的有環(huán)層小體、觸覺(jué)小體、Ruffini小體和肌梭等。環(huán)層小體感受壓覺(jué)和震動(dòng)覺(jué)，觸覺(jué)小體感受觸覺(jué)，Ruffini小體是一種機(jī)械感受器，而肌梭的功能則主要和肌肉活動(dòng)相關(guān)。目前尚未發(fā)現(xiàn)這些感受器和疼痛有直接關(guān)系。

2 SNE形態(tài)學(xué)研究方法

在神經(jīng)解剖學(xué)研究中，1903年西班牙人建了Cajal法［1］，首次顯示了神經(jīng)元內(nèi)的神經(jīng)原纖維及軸突末梢，并因此榮獲諾貝爾獎(jiǎng)。至20世紀(jì)末，各種研究方法層出不窮，神經(jīng)末梢的研究作為分支之一，同樣適合用這些方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察。

2.1 Cajal法 1903 年的 Cajal法［1］，首次顯示末梢與其他神經(jīng)元胞體間的連結(jié)不是連續(xù)的，而是接觸的，并由此建立了神經(jīng)元學(xué)說(shuō)，即神經(jīng)元既是一個(gè)形態(tài)單位，又是一個(gè)功能單位。這個(gè)學(xué)說(shuō)奠定了現(xiàn)代科學(xué)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)。以后各改良方法相繼出現(xiàn)，Cajal吡啶銀染色法顯示神經(jīng)原纖維、神經(jīng)末梢及外周神經(jīng)的再生過(guò)程效果良好，但也存在一定的不足［2］，如對(duì)標(biāo)本的選擇要求非常嚴(yán)格，手術(shù)切除離體后，立即取材，同時(shí)浸入吡啶液固定，否則神經(jīng)原纖維、神經(jīng)末梢及周?chē)坞x神經(jīng)易于變性，影響其顯示。

2.2 潰變軸突與終末鍍銀法 1890年的Marchi法因其不能染軸突及其終末，潰變的時(shí)間有限，已被淘汰。1946年的Gless終末鍍銀法可發(fā)現(xiàn)終末前變性，是順行追蹤該核團(tuán)的投射情況及終止區(qū)的獨(dú)到的方法，一直為神經(jīng)解剖學(xué)研究者所使用。該方法的主要缺點(diǎn)是在核團(tuán)損傷時(shí)，針道損傷的纖維也可染出，干擾了研究結(jié)果。因此自辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)法出現(xiàn)以后，近年來(lái)此法很少被應(yīng)用。目前在銀染法中改良Bielschowsk神經(jīng)末梢染色法較為理想，最大特點(diǎn)是在鏡下可控制其反應(yīng)程度或效果。神經(jīng)組織的浸染，最細(xì)的末梢也能清晰顯示出，而結(jié)締組織著色很淡［3］。

2.3 放射自顯影法 放射自顯影神經(jīng)追蹤(autoradiographic nerve tracing，ARNT)法是20世紀(jì)60年代后期，Lasek等將放射自顯影術(shù)用于神經(jīng)元投射途徑的研究時(shí)建立的。自從1972年 Cowan等首先用ARNT法研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)的纖維聯(lián)系以來(lái)，該法在神經(jīng)科學(xué)界得到廣泛應(yīng)用，逐漸成為追蹤神經(jīng)纖維聯(lián)系的主要技術(shù)之一。該法的問(wèn)世，是神經(jīng)形態(tài)研究方面的又一創(chuàng)新。ARNT法基于軸漿運(yùn)輸?shù)臋C(jī)制。神經(jīng)元的胞體都能合成蛋白質(zhì)，并通過(guò)軸漿來(lái)運(yùn)輸，胞體在合成蛋白質(zhì)時(shí)，對(duì)氨基酸是有選擇性的攝取和運(yùn)輸?shù)?。因此，用放射性核素?biāo)記的氨基酸，被胞體攝取合成蛋白質(zhì)后沿著軸漿的運(yùn)輸路徑可通過(guò)顯影來(lái)進(jìn)行觀察。該種方法比較靈敏，最大優(yōu)點(diǎn)就是不標(biāo)記過(guò)路纖維，克服了HRP法和神經(jīng)纖維潰變法標(biāo)記過(guò)路纖維的缺點(diǎn)。但注射范圍小，對(duì)廣泛起源的通路不適用，而且需要較長(zhǎng)時(shí)間才能觀察結(jié)果，若有偽像與錯(cuò)誤不能及時(shí)得以校正，費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，近年來(lái)也少被應(yīng)用。

2.4 順行示蹤法 HRP示蹤法［4］:1971年，Kristenson和Olsson首先報(bào)道HRP可被神經(jīng)末梢攝取，經(jīng)軸漿逆行運(yùn)輸至神經(jīng)元胞體，然后用組織化學(xué)方法即可顯示出神經(jīng)元的輪廓，從而創(chuàng)建了HRP追蹤神經(jīng)元示蹤技術(shù)，即HRP法。HRP法的基礎(chǔ)是軸漿運(yùn)輸，軸漿運(yùn)輸是神經(jīng)元的一項(xiàng)基本活動(dòng)，即沿其軸突有從胞體向末梢(順向)及從末梢向胞體(逆向)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。HRP法建立的早期，僅用于逆行追蹤，即將HRP注入神經(jīng)的末梢部位，經(jīng)逆行軸漿運(yùn)輸至胞體，再通過(guò)酶組化染色顯示。以后的實(shí)驗(yàn)證明，HRP也可用于順行運(yùn)輸，即將HRP注入神經(jīng)元胞體所在部位，HRP可順向運(yùn)送至末梢部位。此后，為提高HRP本身的靈敏度而有一些結(jié)合HRP的產(chǎn)生，如麥芽凝集素結(jié)合HRP、霍亂毒素B結(jié)合HRP、去霍亂毒素結(jié)合HRP、菜豆凝集素結(jié)合HRP等。HRP方法的問(wèn)世，在神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域中極富價(jià)值，它結(jié)束了自Marchi(1886年)開(kāi)始長(zhǎng)達(dá)一個(gè)世紀(jì)的唯用銀染法追蹤潰變纖維的年代，在神經(jīng)束路追蹤的形態(tài)及功能研究中具有劃時(shí)代的意義。至今，HRP追蹤技術(shù)已可運(yùn)用于逆行追蹤、順行追蹤和跨節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)。HRP的缺點(diǎn)是在中樞注射區(qū)有向周?chē)鷶U(kuò)散現(xiàn)象，可采用微量注射或微電泳導(dǎo)入技術(shù)加以克服。而其究竟能被末梢攝取的有效范圍有多大，至今尚無(wú)十分準(zhǔn)確的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

葡聚糖是由腸系膜明串珠菌產(chǎn)生的多聚體，分子量有大有小，用于示蹤的葡聚糖相對(duì)分子質(zhì)量一般為3×103。葡聚糖與不同的標(biāo)志物結(jié)合形成各種追蹤劑。較常用的有四甲基羅達(dá)明葡聚糖胺和生物素葡聚糖胺(biotinylated-dextran amine，BDA)，兩者均可用于順行和逆行追蹤，但BDA的順行追蹤結(jié)果優(yōu)于逆行追蹤。BDA與卵白素之間有特別強(qiáng)的親和力，常用結(jié)合了過(guò)氧化物酶或熒光素的卵白素與之孵育結(jié)合，通過(guò)組化反應(yīng)或熒光顯微鏡觀察顯示標(biāo)記結(jié)果。葡聚糖追蹤法的優(yōu)點(diǎn)是:注射部位局限，動(dòng)物存活時(shí)間較短，顯示反應(yīng)程序簡(jiǎn)單，靈敏度高，能進(jìn)行多重順行追蹤標(biāo)記。

2.5 熒光組織化學(xué)及免疫組織細(xì)胞化學(xué)法 1962年Falck-Hillarp發(fā)現(xiàn)了甲醛誘發(fā)熒光法，此法可使神經(jīng)元內(nèi)所含的單胺類(lèi)物質(zhì)與醛聚合成新的環(huán)形化合物，在熒光顯微鏡下發(fā)射出波長(zhǎng)不同的熒光。用熒光顯微鏡觀察，兒茶酚胺末梢和細(xì)胞呈綠色熒光。5-羥色胺神經(jīng)元及末梢呈黃色熒光。此法用甲醛蒸氣，需冷凍干燥裝置，比較麻煩。1972年瑞典學(xué)者Bjorklund和Lindvail創(chuàng)立乙醛酸誘發(fā)熒光法，手續(xù)簡(jiǎn)便，也得到同樣效果。至今已有許多改良的技術(shù)，使該技術(shù)的敏感性和特異性大為提高。

20世紀(jì)70年代至今，免疫組織化學(xué)方法廣泛應(yīng)用于神經(jīng)解剖學(xué)的研究，它利用制備的特異性抗體血清(或單、多克隆抗體)與神經(jīng)組織或細(xì)胞中相應(yīng)的抗原結(jié)合。把相應(yīng)的抗原諸如 PGP9.5［5，6］、降鈣素基因相關(guān)肽、P物質(zhì)［7］等作為標(biāo)志物，顯示不同功能的神經(jīng)纖維陽(yáng)性反應(yīng)。此結(jié)合的顯示有直接法和間接法。直接法步驟簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、敏感性差。間接法顯示抗原抗體結(jié)合物的靈敏度高，一般用羊抗兔作為第二抗體與第一抗體上的抗原結(jié)合，或用熒光素與第二抗體結(jié)合，也可用靈敏度高的HRP或卵白素生物素過(guò)氧化物酶復(fù)合體與第二抗體結(jié)合，以顯示抗原抗體結(jié)合物在神經(jīng)細(xì)胞體或其神經(jīng)末梢的存在。

3 軀干四肢SNE形態(tài)學(xué)的研究

SNE廣泛分布于身體各個(gè)部位，本文僅對(duì)臨床上四肢和軀干易于發(fā)生軟組織疼痛的部位按解剖層次進(jìn)行分述。

3.1 皮膚內(nèi) SNE 的研究 Cauna［8］應(yīng)用 Bielscho wsky神經(jīng)末梢染色法于光、電鏡下研究人手指皮膚游離神經(jīng)末梢的精細(xì)形態(tài)，實(shí)驗(yàn)未麻醉，于指部直接活檢取材。研究中見(jiàn)有大量形態(tài)不同的游離神經(jīng)末梢分布于指部，光鏡下計(jì)數(shù)換算后每1 mm2約有各形態(tài)軸突末梢250個(gè)。末梢多垂直于皮膚表面，每一末梢支配一定表面區(qū)域，與臨近末梢不重疊，這樣的結(jié)構(gòu)具備更好的精細(xì)觸覺(jué)和兩點(diǎn)辨別覺(jué)。這一點(diǎn)明顯不同于有毛皮皮膚的神經(jīng)末梢分布。該方法的缺點(diǎn)是在材料的選擇上，對(duì)顯示游離神經(jīng)末梢的選材以人的口唇或小白鼠上唇為好，觸覺(jué)小體的選材以人指尖掌側(cè)為好，這使得此方法有一定局限性，同時(shí)本方法不適于大批標(biāo)本的制作［9］。

Marfurt等［10］通過(guò)在SD大鼠三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)注射HRP追蹤其順行運(yùn)輸分布部位，在24～48 h內(nèi)分別處死各組大鼠，常規(guī)組織取材，切片、四甲基聯(lián)苯胺顯色，光鏡下觀察。HRP可被運(yùn)輸?shù)礁鱾€(gè)神經(jīng)末梢，在角膜、觸須毛囊、牙髓、牙周組織、面部皮膚均可見(jiàn)其蹤跡，在其軸突及末梢內(nèi)比較密集，能夠清楚地顯示標(biāo)記結(jié)構(gòu)的位置和形態(tài)。Marfurt認(rèn)為，本法標(biāo)記后比較容易將神經(jīng)纖維和末梢與其他組織區(qū)分，結(jié)果優(yōu)于銀染法，因在銀染法下，由于其他組織，例如，網(wǎng)狀纖維或彈性纖維的嗜銀性，使得神經(jīng)組織不易與之鑒別。在另一項(xiàng)研究再生神經(jīng)纖維的分布的實(shí)驗(yàn)中［11］，研究者采用CB-HRP順行示蹤技術(shù)，驗(yàn)證再生纖維的來(lái)源和分布。實(shí)驗(yàn)中行部分椎板切除術(shù)，顯露神經(jīng)節(jié)，用玻璃顯微吸管將4 μL的2%CBHRP注入神經(jīng)節(jié)，動(dòng)物存活96 h，以甲醛混合液進(jìn)行心臟灌注。取下神經(jīng)節(jié)及移植皮瓣存于含10%蔗糖的磷酸緩沖液中12 h，冷凍切片，四甲基聯(lián)苯胺法進(jìn)行呈色，光鏡下進(jìn)行觀察。經(jīng)1、2、4、6個(gè)月觀察證實(shí)失神經(jīng)皮瓣獲得神經(jīng)再支配是依賴(lài)植入的神經(jīng)，而不是周?chē)つw內(nèi)神經(jīng)的長(zhǎng)入。這種方法能區(qū)分粗大及纖細(xì)的神經(jīng)纖維，而且由于將CB-HRP注射于脊髓背根節(jié)，因此可以了解外周皮膚某一區(qū)域內(nèi)的神經(jīng)末梢分布情況。

3.2 筋膜SNE的研究 在胸腰筋膜神經(jīng)分布的研究中，Stilwell［12］發(fā)現(xiàn)，比較大的環(huán)層小體及類(lèi)似環(huán)層小體的小團(tuán)狀物和高爾基腱器官小體。而Hirsch等［13］僅觀察到精細(xì)的游離神經(jīng)纖維和一些沒(méi)有被囊的末梢復(fù)合體。鑒于當(dāng)時(shí)實(shí)驗(yàn)條件限制，這些研究主要應(yīng)用的是硝酸銀浸染及亞甲基藍(lán)染色，沒(méi)有能夠特異地對(duì)神經(jīng)組織進(jìn)行染色。

針對(duì)這種情況，Yahia等［14］在1992年應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)來(lái)研究胸腰筋膜神經(jīng)分布，通過(guò)對(duì)神經(jīng)絲蛋白及S100蛋白血清抗體免疫化學(xué)染色，對(duì)患者術(shù)后胸腰筋膜進(jìn)行研究，光鏡下除發(fā)現(xiàn)游離神經(jīng)末梢外，同時(shí)觀察到兩種機(jī)械感受器(Ruffini末梢及環(huán)層小體)，研究中對(duì)神經(jīng)絲蛋白只觀察到陽(yáng)性神經(jīng)束，未見(jiàn)其他末梢小體結(jié)構(gòu)，而針對(duì)S100蛋白抗血清則觀察到Ruffini末梢及環(huán)層小體。說(shuō)明兩種不同的方法適用于不同的感覺(jué)神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)。采用神經(jīng)組織化學(xué)方法［15］，通過(guò)乙醛酸誘發(fā)熒光法對(duì)家兔頸椎前軟組織內(nèi)腎上腺素能神經(jīng)、膽堿能神經(jīng)進(jìn)行觀察。結(jié)果在椎前筋膜內(nèi)觀察到腎上腺素能纖維有廣泛的分布;乙酰膽堿酯酶陽(yáng)性纖維少量散在于其間。從形態(tài)學(xué)上證明頸椎前軟組織內(nèi)存在大量的交感神經(jīng)末梢。另一項(xiàng)研究中［16］采用放射性核素示蹤技術(shù)，對(duì)注入家兔頸后交感神經(jīng)節(jié)的核素32P順行追蹤到頸椎前軟組織，觀察到交感神經(jīng)有分支分布到頸椎前縱韌帶和椎前筋膜。

3.3 肌肉SNE的研究 肌組織中除肌張力感受器外，75%骨骼肌的感覺(jué)神經(jīng)來(lái)自肌筋膜中的游離神經(jīng)末梢，走行于肌纖維和血管之間，屬于有髓的Aδ和無(wú)髓的C纖維，是肌傷害感受器。Marina［17］觀察到機(jī)體的肌肉傷害感受器屬機(jī)械感受性，閾值低于肌痛閾。在小鼠皮大肌降鈣素基因相關(guān)肽免疫反應(yīng)(calcitonin gene-related peptide immunoreactive，CGRP-IR)神經(jīng)纖維分布的研究中［18］，針對(duì)小鼠皮膚進(jìn)行整裝鋪片、石蠟切片、CGRP-IR卵白素-生物素-酶復(fù)合物染色法(ABC法)染色。光鏡下觀察，皮膚整裝鋪片上可見(jiàn)到真皮及皮大肌CGRP-IR神經(jīng)纖維網(wǎng)，皮大肌的CGRP-IR神經(jīng)纖維與肌纖維形成運(yùn)動(dòng)終板。應(yīng)用Sihler染色法，觀察到家兔不同形態(tài)肌的肌內(nèi)神經(jīng)分支分布與肌纖維排列有關(guān);肌內(nèi)神經(jīng)分支走行有與肌束平行和(或)垂直兩種形式［19］。Sihler染色法早年用于染肌梭，后經(jīng)改良，目前已成為研究骨骼肌肌內(nèi)神經(jīng)的重要方法。其優(yōu)點(diǎn)是在不損傷肌外形的情況下，清楚地顯示了原來(lái)肉眼不能見(jiàn)到的肌束與肌內(nèi)神經(jīng)分支的三維關(guān)系，為神經(jīng)肌肉移植、電生理研究等提供了可靠的形態(tài)學(xué)依據(jù)［20］。

4 結(jié)語(yǔ)

目前對(duì)臨床中常見(jiàn)的各種軀干、四肢軟組織疼痛的研究，大多集中在血生化及電生理學(xué)等方面，而在組織學(xué)上，疼痛的感覺(jué)終器主要由感覺(jué)神經(jīng)末稍引起，那么在病變后其形態(tài)學(xué)如何變化，目前在基礎(chǔ)研究中這一點(diǎn)備受關(guān)注。SNE形態(tài)的研究，大多建立在基本神經(jīng)形態(tài)學(xué)研究方法之上。在具體研究中根據(jù)研究課題的需要，可以幾種方法結(jié)合，如銀染法、雙重?zé)晒馑貥?biāo)記或標(biāo)記后又進(jìn)行免疫組化反應(yīng)、HRP法與免疫組化法結(jié)合等，這樣既能了解神經(jīng)末梢分布情況，又可知道其細(xì)胞的化學(xué)性質(zhì)，為闡明某一病變提供形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

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