對(duì)氧磷酶-1在糖尿病眼部并發(fā)癥中的作用研究進(jìn)展△

禹倩倩 綜述 姚 勇 審校

對(duì)氧磷酶(paraoxonase，PON)是一類能催化水解磷酸酯鍵的芳香酯酶。該酶可降解有機(jī)磷酸酯、芳香羧酸酯及氨基甲酸酯等，更為重要的是還可以減少過(guò)量過(guò)氧化物、氧化型磷脂的生成。目前研究發(fā)現(xiàn)，PON的活性改變與有機(jī)磷中毒、心腦血管疾病、糖尿病及其并發(fā)癥均有關(guān)。隨著人口老齡化的加快和人民生活水平的提高，糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生率逐步上升，使得PON與糖尿病及其并發(fā)癥的關(guān)系成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。目前糖尿病視網(wǎng)膜病變和糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生靠單純的血糖控制并不能達(dá)到較好的預(yù)防和控制的目的，因此超越以葡萄糖為中心的糖尿病防治新策略已逐漸受到重視。研究糖尿病患者PON-1活性的變化與糖尿病視網(wǎng)膜病變和糖尿病性白內(nèi)障的關(guān)系以探討其相關(guān)的危險(xiǎn)因素，可為糖尿病眼部并發(fā)癥的防治提供新思路。

1 PON的生物學(xué)特性

1.1 PON家族 1964年，首次報(bào)道了在動(dòng)物組織內(nèi)存在一種能水解有機(jī)磷酸鹽的酶［1］。這種酶的發(fā)現(xiàn)使得人類開始了對(duì)血漿PON-1的鑒定，該酶可水解殺蟲劑對(duì)硫磷的毒性代謝產(chǎn)物。

人類PON基因家族包括3個(gè)成員:PON-1、PON-2和PON-3，它們相互緊靠著在7q21.3～22.1染色體的長(zhǎng)臂上。人類PON-1和PON-2主要在肝臟合成并被分泌到血液中，均能在血液中與高密度脂蛋白相結(jié)合，但是PON-1幾乎獨(dú)占了高密度脂蛋白。大部分PON-3在肝臟內(nèi)表達(dá)，在腎臟內(nèi)低水平表達(dá)。在鼠類的巨噬細(xì)胞中已檢測(cè)到PON-3的mRNA和蛋白，但在人巨噬細(xì)胞中不存在［2］。PON家族的3個(gè)成員的mRNA在胃腸道都有表達(dá)，然而在蛋白水平僅有PON-2表達(dá)［3］。PON-2幾乎表達(dá)在所有組織，但在血漿中卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，可能的原因是存在復(fù)雜的mRNA形式。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析論，發(fā)現(xiàn)PON-2是該酶家族中最老的成員［4］。

1.2 PON的功能 PON-1能可逆地結(jié)合并水解有機(jī)磷酸鹽，是神經(jīng)系統(tǒng)免受進(jìn)入循環(huán)的有機(jī)磷酸鹽毒害的主要途徑，而且酯酶活性和內(nèi)酯酶活性可阻止低密度脂蛋白的氧化和水解同型半胱氨酸硫代內(nèi)酯。體外測(cè)定表明，PON-1和PON-3能夠抑制低密度脂蛋白的脂質(zhì)氧化，動(dòng)脈粥樣硬化的啟動(dòng)和進(jìn)展與氧化脂質(zhì)水平的降低有關(guān)［5］。

PON-1能抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的生物合成和刺激巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的外流［6-8］，還可以代謝膽固醇酯等過(guò)氧化物類物質(zhì)。PON的抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用活性與在高密度脂蛋白微粒上的定位密切相關(guān)。高密度脂蛋白有2個(gè)關(guān)鍵點(diǎn):一個(gè)是膽固醇流出的調(diào)節(jié)，還有一個(gè)是低密度脂蛋白脂質(zhì)氧化的限制［9］。在高密度脂蛋白的保護(hù)功能中PON起了一個(gè)中樞的作用［8，10］。PON-1在高密度脂蛋白的糖化易感性中也有調(diào)節(jié)性作用［11］。低密度脂蛋白第283位上的半胱氨酸在低密度脂蛋白的抗氧化作用中是必不可少的，但是這個(gè)半胱氨酸與有機(jī)磷酸鹽的水解無(wú)關(guān)?？梢哉f(shuō)明，PON可能有2個(gè)不同的催化位點(diǎn)，2種功能被不同的構(gòu)象激活。近年的研究表明，PON可以水解酰基絲氨酸內(nèi)酯類物質(zhì)，該分子調(diào)節(jié)細(xì)菌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這一信號(hào)對(duì)調(diào)節(jié)毒性因子的表達(dá)和誘導(dǎo)宿主的炎癥反應(yīng)是非常重要的［12］。

1.3 PON的基因多態(tài)性 PON基因啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)基因多態(tài)性，會(huì)影響酶的表達(dá)和血漿酶的濃度。107 C＞T的基因多態(tài)性是PON-1濃度最重要的決定基因［13］。PON-1基因的編碼區(qū)包括2個(gè)多態(tài)位點(diǎn):在第55位上亮氨酸和甲硫氨酸的轉(zhuǎn)換(55 L＞M);第192位上谷氨酰胺和精氨酸的轉(zhuǎn)換(192 Q＞R)。由于PON-1啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性的連鎖，55 L＞M的基因多態(tài)性會(huì)影響PON-1的活性。另外，55 L＞M多態(tài)性定位在 PON-1的 N末端，在PON-1和高密度脂蛋白的結(jié)合中起了重要的作用。192 Q＞R多態(tài)性在酶的水解活性中負(fù)責(zé)識(shí)別物質(zhì)特有的差異。氨基酸在192(QR)位置上的置換會(huì)增加2個(gè)同種異型酶。在體外研究中Q型同種異型酶抵抗過(guò)氧化脂質(zhì)在低密度脂蛋白的蓄積比R型能給予更大的保護(hù)。

2 PON與糖尿病眼部并發(fā)癥

2.1 PON與糖尿病視網(wǎng)膜病變 PON表達(dá)酯酶活性和內(nèi)酯酶活性，內(nèi)酯酶活性作為糖尿病視網(wǎng)膜病變微血管并發(fā)癥的一個(gè)危險(xiǎn)因素在玻璃體方面的研究目前還沒(méi)有報(bào)道。在體外研究中，將牛視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞暴露在同型半胱氨酸硫代內(nèi)酯和同型半胱氨酸中，結(jié)果顯示:PON-內(nèi)酯酶活性和PON-2 mRNA表達(dá)存在劑量與時(shí)間的正相關(guān)，而且PON-內(nèi)酯酶活性會(huì)增高2～3倍，但是酯酶活性是顯著降低的。視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)同型半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)存在差異，而同型半胱氨酸化蛋白介導(dǎo)了糖尿病大血管和微血管并發(fā)癥的形成和發(fā)展［14-15］。有研究報(bào)道，糖尿病患者血漿中PON-內(nèi)酯酶活性和PON-酯酶活性是顯著降低的［16］，糖尿病視網(wǎng)膜病變受試者玻璃體內(nèi)的內(nèi)酯酶和PON-內(nèi)酯酶活性顯著增高。玻璃體內(nèi)的PON活性增高可能會(huì)導(dǎo)致內(nèi)層視網(wǎng)膜屏障通透性的改變和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，這正是糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病機(jī)制的特征。玻璃體內(nèi)PON-內(nèi)酯酶活性的增高對(duì)抵消同型半胱氨酸硫代內(nèi)酯引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙有積極的意義［17］，同時(shí)增高的同型半胱氨酸可能會(huì)導(dǎo)致PON-酯酶活性的降低。

有報(bào)道稱2型糖尿病患者的PON-1活性明顯降低，而血漿氧化型低密度脂蛋白濃度增高。但個(gè)別研究者并不支持這個(gè)結(jié)論，指出PON對(duì)體內(nèi)的低密度脂蛋白氧化沒(méi)有作用［18］。1型糖尿病患者的PON-1活性亦處在一個(gè)較低的水平［19］。1型糖尿病患者無(wú)糖尿病視網(wǎng)膜病變組的PON-1活性與無(wú)糖尿病組相比無(wú)顯著性降低，但1型糖尿病患者糖尿病視網(wǎng)膜病變組PON-1的活性比無(wú)糖尿病的對(duì)照組要低，而且也比無(wú)糖尿病視網(wǎng)膜病變組要低，這樣可以確定脂質(zhì)氧化在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制中扮演了一個(gè)重要的角色［20］。

血漿PON活性是糖尿病視網(wǎng)膜病變的重要因素，糖尿病微血管并發(fā)癥的患者PON活性是降低的。糖尿病無(wú)并發(fā)癥對(duì)照組的PON-1活性明顯比患糖尿病視網(wǎng)膜組的高，但是濃度上2組沒(méi)有差異。PON基因多態(tài)性能顯著影響PON的活性。PON-1-55、PON-1-192和PON-2-310基因多態(tài)性的基因頻率在研究人群中是沒(méi)有差異的。對(duì)照組和2型糖尿病試驗(yàn)組的 PON-1-55、PON-2-310和 PON-1-192基因多態(tài)性影響PON-1的活性:同是2型糖尿病，PON-2-310CC基因型的個(gè)體比非此基因型個(gè)體的PON-1活性明顯增高;同是PON-2-310CC基因型，無(wú)并發(fā)癥組比糖尿病視網(wǎng)膜病變組PON-1濃度也顯著降低。以上研究結(jié)果表明:2型糖尿病并發(fā)視網(wǎng)膜病變時(shí)，PON-2基因可影響PON-1基因，也可影響血糖的控制。血糖水平與血漿PON濃度及其生物活性呈負(fù)相關(guān)。血漿PON的濃度和活性可能會(huì)成為監(jiān)測(cè)晚期微血管并發(fā)癥的一個(gè)標(biāo)志物?；蛐虲C(-107)、GG(-126)和CC(-907)都有相互獨(dú)立的效應(yīng)。糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展與基因型CC(-907)有著非常顯著的關(guān)聯(lián)。在logistic回歸模型中，等位基因CC(-907)、糖尿病病程長(zhǎng)和高收縮壓都是獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。每一種基因型均能顯著影響至少2種底物(對(duì)氧磷和乙酸苯酯)反應(yīng)活性的一種。當(dāng)?shù)孜锸菍?duì)氧磷，基因型55 L明顯比基因型192 R的PON活性高，但是當(dāng)?shù)孜锸且宜岜锦?，結(jié)果則相反。GG(-907)純合子的PON活性水平高，可以延緩糖尿病視網(wǎng)膜病變的進(jìn)展［21］。PON-1CC(-907)和 GG(-907)編碼了活性高的PON，但是在高密度脂蛋白對(duì)抗低密度脂蛋白的氧化作用時(shí)，這2種基因型的保護(hù)性卻是最低的。多態(tài)性啟動(dòng)子CG(-907)可影響糖尿病視網(wǎng)膜病變的進(jìn)展，如果一個(gè)等位基因C在-907位置出現(xiàn)，那么糖尿病視網(wǎng)膜病變的危險(xiǎn)性會(huì)增加3倍［21］。在血管并發(fā)癥中PON基因的作用是很復(fù)雜的，這可能牽涉到PON基因與糖尿病并發(fā)癥患者的PON-1、PON-2、PON-3擴(kuò)增的單鏈染色體基因之間的研究。大量研究也清晰地指出了PON-1基因多態(tài)性對(duì)PON活性的影響，也鑒定出具有糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)展危險(xiǎn)性的PON-1基因型。生理學(xué)上，PON基因型可能只會(huì)影響一部分PON活性，其他影響的因素可能還包括PON-2、PON-3基因的酶表達(dá)及其環(huán)境［21］。因此，未來(lái)的研究有必要鑒定和確定基因標(biāo)志物，這樣可以針對(duì)有危險(xiǎn)因素的人群進(jìn)行基因篩查。

2.2 PON與糖尿病性白內(nèi)障 近來(lái)報(bào)道PON-1活性在糖尿病性白內(nèi)障和年齡相關(guān)性白內(nèi)障受試者的血漿中降低，在糖尿病性白內(nèi)障受試者血漿中降低更顯著［22］。在白內(nèi)障受試者的血漿中PON-1活性處在一個(gè)下降的水平。隨后檢驗(yàn)了糖尿病性白內(nèi)障組和非白內(nèi)障組的 PON-1活性，發(fā)現(xiàn)白內(nèi)障組PON-1活性顯著下降。進(jìn)一步對(duì)白內(nèi)障患者的晶狀體組織研究，RT-PCR分析提示存在PON-1 mRNA，而PON-2和PON-3的mRNA表達(dá)則未檢測(cè)到。免疫組織化學(xué)分析中使用人類PON-1抗體，顯示在晶狀體赤道部抗體有較強(qiáng)的反應(yīng)。此外，晶狀體微粒體蛋白印跡分析證明了單條PON-1結(jié)合了自己的抗體，表明了PON-1蛋白在人類晶狀體表達(dá)。PON-1酶活性檢測(cè)提出，相比年齡相關(guān)性白內(nèi)障，糖尿病性白內(nèi)障患者晶狀體內(nèi)PON-1的活性是顯著降低的。通過(guò)模式研究發(fā)現(xiàn)，PON-1的結(jié)構(gòu)在糖化作用的影響下，其三維結(jié)構(gòu)由重組的PON構(gòu)成，這一結(jié)構(gòu)具有六個(gè)β螺旋結(jié)構(gòu)。戊糖苷殘基附著于PON-1的賴氨酸70和賴氨酸75上，形成了糖化的異體PON-1［23］。

白內(nèi)障是一類多因素引起的疾病，由于晶狀體透明度的降低而導(dǎo)致的正常視覺(jué)受損。發(fā)病的機(jī)制之一是抗氧化劑和活性氧之間失衡而發(fā)生氧化損傷，使晶狀體變成不透明。與自身其他的細(xì)胞一樣，晶狀體組織有維持氧化平衡的防御機(jī)制。早期的研究表明，在白內(nèi)障的晶狀體樣本中有類似于過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽系統(tǒng)這樣的抗氧化酶水平降低［24］。PON是抗氧化酶家族的新成員。

關(guān)于PON家族的組織分布，基因和蛋白表達(dá)的信息是非常有限的。最近有研究對(duì)正常小鼠PON-1、PON-2、PON-3的免疫化學(xué)定位發(fā)現(xiàn)，在小鼠晶狀體內(nèi)有PON-1和PON-3，該研究認(rèn)為這2種蛋白的分布在小鼠與人之間是不同的［25］。后來(lái)的研究指出:在人晶狀體組織只有PON-1存在，在晶狀體的赤道部可觀察到明顯的染色，晶狀體微粒體蛋白印跡分析證明了PON-1蛋白條帶的存在，確認(rèn)了PON-1的表達(dá)［23］。PON-1可能在局部合成保護(hù)晶狀體組織免受氧化損害，這一論點(diǎn)已經(jīng)在小鼠晶狀體組織中予以證實(shí)。雖然PON生理學(xué)的底物認(rèn)為未知，但是由于PON已被廣泛認(rèn)為有抗氧化的作用，所以PON-1在人晶狀體中能檢測(cè)到其表達(dá)并不出乎意料。

糖尿病的主要發(fā)病機(jī)制還不明確，但已有大量研究表明氧化應(yīng)激是糖尿病的主要發(fā)病機(jī)制。氧化應(yīng)激包括葡萄糖自氧化、高級(jí)糖基化終產(chǎn)物和多途徑激活，所有過(guò)程都能在白內(nèi)障的形成中觀察到。因此，相比年齡相關(guān)性白內(nèi)障，在糖尿病性白內(nèi)障患者晶狀體內(nèi)發(fā)現(xiàn)更低水平的PON-1表達(dá)。由于氧化應(yīng)激能使PON-1失活，而導(dǎo)致糖尿病受試者PON-1活性降低。脂質(zhì)過(guò)氧化的程度與晶狀體混濁的進(jìn)展存在相關(guān)性［26］。PON有對(duì)抗低密度脂蛋白的氧化作用，丙二醛是脂質(zhì)過(guò)氧化的標(biāo)志物，是評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激程度常規(guī)分析的指標(biāo)。研究者分析白內(nèi)障晶狀體組織里的丙二醛水平和PON-1的酶活性，結(jié)論與更早期的研究是一致的;相對(duì)于年齡相關(guān)性白內(nèi)障，在糖尿病性白內(nèi)障晶狀體中丙二醛是顯著增高的。此外，丙二醛水平和PON活性之間還存在一種負(fù)相關(guān)關(guān)系［23］。當(dāng)PON-1被氧化的低密度脂蛋白抑制時(shí)，脂質(zhì)過(guò)氧化和PON-1呈負(fù)相關(guān)。早期的研究表明，PON對(duì)糖化作用很敏感，糖化后PON活性會(huì)降低40%。對(duì)比無(wú)糖基化的結(jié)構(gòu)，糖基化后PON-1結(jié)構(gòu)顯示，在頂部活性中心插入了戊糖苷，在底部有催化性的二聯(lián)體和其他一些重要的殘基。這表明氨基酸側(cè)鏈的置換或是微小的改變都可能干擾鄰近的殘基或是引起鈣結(jié)合部位大小的改變［27］。模型研究表明，PON-1的糖化發(fā)生在賴氨酸70和賴氨酸75，這可能對(duì)底物的結(jié)合產(chǎn)生了阻礙。在糖基化模型中，催化活性二元體的方向沒(méi)有改變，但是在賴氨酸70和賴氨酸75上的戊糖苷分子存在影響了底物的結(jié)合，或是使得活性中心無(wú)法利用底物，結(jié)構(gòu)上的改變降低了 PON 的活性［23］。

3 小結(jié)

1 型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者其PON-1活性下降，表明PON-1在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制中起重要的作用。鑒定出具有糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)展危險(xiǎn)性的PON-1的基因型，則可針對(duì)有危險(xiǎn)因素的人群進(jìn)行基因篩查，對(duì)早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)防提供參考依據(jù)。PON-1在糖尿病性白內(nèi)障方面，今后要探索其在人白內(nèi)障晶狀體中的表達(dá)差異的作用機(jī)制。在晶狀體內(nèi)PON-1擔(dān)任著抗氧化酶的角色，其在晶狀體組織表達(dá)提供了一種研究由氧化應(yīng)激而導(dǎo)致?lián)p傷的酶的作用模型。

在過(guò)去的10 a，人類流行病和實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)PON發(fā)揮了重要的抗氧化保護(hù)性作用。這一發(fā)現(xiàn)使得PON的研究成為了一個(gè)重要的闡明疾病發(fā)病機(jī)制的途徑。疾病的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的現(xiàn)象，需進(jìn)一步闡述在疾病發(fā)生過(guò)程中PON潛在功能中基因多態(tài)性的作用，且PON作為一種蛋白質(zhì)，其活性有賴于正確的空間構(gòu)象;形成其正確的空間構(gòu)象有賴于細(xì)胞內(nèi)特定的酶反應(yīng)體系，今后還需進(jìn)一步研究是酶反應(yīng)體系對(duì)PON活性的改變機(jī)制。因此，對(duì)于疾病的干預(yù)，PON活性和基因突變的藥理學(xué)調(diào)節(jié)可以構(gòu)成一個(gè)有效的途徑。目前PON已經(jīng)深入地融匯到體內(nèi)穩(wěn)態(tài)機(jī)制的認(rèn)識(shí)中。在不遠(yuǎn)的未來(lái)，PON激動(dòng)劑的發(fā)展可能幫助我們對(duì)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)紊亂有一個(gè)有效的治療作用。

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