乳核內(nèi)消液微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證

蘭鴻，李元宏，楊務(wù)彬

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院藥學(xué)部，湖北十堰 442000)

乳核內(nèi)消液功能主治為疏肝活血，軟堅(jiān)散結(jié)。處方中浙貝母、柴胡、赤芍、夏枯草均具有抑菌作用;按照2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部附錄ⅩⅢC微生物限度檢查法［1］的要求，筆者對(duì)乳核內(nèi)消液進(jìn)行了細(xì)菌數(shù)、真菌數(shù)和酵母菌數(shù)測(cè)定，及控制菌大腸埃希菌的檢查，建立微生物限度檢查方法，并加以驗(yàn)證［2］。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LDZX-40BI立式自動(dòng)電熱壓力蒸氣滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)，DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，HH·B11·600型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，LRH-150B生化培養(yǎng)箱(廣東醫(yī)療器械廠)，超凈臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)。

1.2 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，膽鹽乳糖培養(yǎng)基，膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，改良馬丁培養(yǎng)基，改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基，4-甲基傘形花內(nèi)酯-β-D-葡萄糖苷酸培養(yǎng)基，曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(四川省食品藥品檢驗(yàn)所)。

1.3 陽(yáng)性對(duì)照菌 金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］，大腸埃希菌［CMCC(B)44102］，枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63501］，白念珠菌［CMCC(F)98001］，黑曲霉菌［CMCC(F)98003］(四川省食品藥品檢驗(yàn)所)。

1.4 供試品 乳核內(nèi)消液(四川省新鹿藥業(yè)有限公司，批號(hào):100401，100402，100403)。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試液制備 取供試品10 mL，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，混勻，作為1∶10供試液。

2.2 陽(yáng)性對(duì)照菌液的制備 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋制成每毫升含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液，備用;接種白念珠菌的新鮮培養(yǎng)物于改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)24 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋制成每毫升含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液，備用;接種黑曲霉菌的新鮮培養(yǎng)物于改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)5 d，加入含容積分?jǐn)?shù)為0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液5 mL將孢子洗脫，吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含容積分?jǐn)?shù)為0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋制成每毫升含孢子數(shù)50～100 cfu的孢子懸液，備用［3］。

2.3.1 常規(guī)法 取供試液1 mL注入平皿。

2.3.2 培養(yǎng)基稀釋法 第一法:取供試液1 mL注入5個(gè)平皿中(每個(gè)平皿0.2 mL);第二法:取供試液1 mL注入10個(gè)平皿中(每個(gè)平皿0.1 mL)。

2.3.3 薄膜過濾法 取供試液10 mL，加至pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL中，混勻，薄膜過濾，總沖洗量為300 mL。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

2.4.1 實(shí)驗(yàn)組 取規(guī)定量供試液及各實(shí)驗(yàn)菌50～100 cfu，分別注入同一平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平皿，凝固后，置規(guī)定溫度下，細(xì)菌培養(yǎng)24～48 h，白念珠菌和黑曲霉菌培養(yǎng)48～72 h。

2.4.2 菌液組 取各實(shí)驗(yàn)菌50～100 cfu注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平皿，凝固后，置規(guī)定溫度下，細(xì)菌培養(yǎng)24～48 h，白念珠菌和黑曲霉菌培養(yǎng)48～72 h，測(cè)定所加入的實(shí)驗(yàn)菌數(shù)。

2.4.3 供試品對(duì)照組 取規(guī)定量供試液，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，凝固后，置規(guī)定溫度下，細(xì)菌培養(yǎng)24～48 h，白念珠菌和黑曲霉菌培養(yǎng)48～72 h，測(cè)定供試品本底菌數(shù)。

2.4.4 稀釋劑對(duì)照組 取稀釋劑pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液1 mL和實(shí)驗(yàn)菌50～100 cfu，分別注入同一平皿中，考察稀釋劑對(duì)實(shí)驗(yàn)有無干擾［4］。

2.4.5 回收率的計(jì)算 回收率(%)=(實(shí)驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)×100%。

馬克思主義認(rèn)為公共產(chǎn)品供給方式與生產(chǎn)力的發(fā)展水平是呈正相關(guān)的，當(dāng)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平低的時(shí)候，公共產(chǎn)品供給方式比較單一，而當(dāng)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平較高時(shí)，就可以采取多種方式實(shí)現(xiàn)公共服務(wù)供給［8］179。在《不列顛在印度的統(tǒng)治》中，馬克思通過對(duì)東西方節(jié)約用水和共同用水方式比較，得出在西方經(jīng)濟(jì)發(fā)展高的國(guó)家除采取政府供給方式外還可以采取私人企業(yè)家聯(lián)合供給的方式，而在東方則由于工業(yè)文明程度低，只能采用政府單一供給的方式。

2.5 稀釋劑干擾實(shí)驗(yàn) 使用常規(guī)法對(duì)稀釋劑進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果稀釋劑對(duì)照組大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌、黑曲霉菌平均回收率分別為94.5%，105.3%，98.9%，95.8%，93.3%，表明稀釋劑pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液無抑菌作用，對(duì)實(shí)驗(yàn)無干擾，見表1。

2.6 細(xì)菌數(shù)、真菌數(shù)和酵母菌數(shù)測(cè)定方法的確定對(duì)乳核內(nèi)消液按常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法(每個(gè)平皿0.2 mL)、培養(yǎng)基稀釋法(每個(gè)平皿0.1 mL)、薄膜過濾法(每個(gè)平皿沖洗量300 mL)的順序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在薄膜過濾法實(shí)驗(yàn)中，另設(shè)稀釋劑對(duì)照組，取稀釋劑10 mL，薄膜過濾，用0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，在最后一次沖洗液中加入實(shí)驗(yàn)菌50～100 cfu，過濾，取出濾膜，菌面朝上貼于瓊脂平板，置規(guī)定溫度培養(yǎng)48h觀察，測(cè)定稀釋劑對(duì)照組的回收率。用3批乳核內(nèi)消液樣品進(jìn)行驗(yàn)證。見表2，3。

表1 稀釋劑回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果cfu

表2 消除供試品抑菌活性回收率 %

乳核內(nèi)消液的微生物限度檢驗(yàn)結(jié)果表明，真菌、酵母菌采用常規(guī)法其回收率均＞70%，采用薄膜過濾法(每個(gè)平皿沖洗量300 mL)，可確保細(xì)菌數(shù)的回收率均＞70%，符合《中華人民共和國(guó)藥典》的規(guī)定，方法可行。

表3 乳核內(nèi)消液回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 %

2.7 控制菌大腸埃希菌檢驗(yàn)方法的建立及驗(yàn)證

2.7.1 菌液制備 菌液制備同“2.2”。

2.7.2 常規(guī)法 實(shí)驗(yàn)組:取1∶10供試液10 mL接種至100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基，同時(shí)加入大腸埃希菌50～100 cfu，35℃培養(yǎng)24～48 h。取培養(yǎng)物0.2 mL接種至含4-甲基傘形花內(nèi)酯-β-D-葡萄糖苷酸培養(yǎng)基5 mL的試管中，35℃培養(yǎng)24 h，366 nm紫外燈下觀察熒光，然后進(jìn)行靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)。另取培養(yǎng)物劃線接種于署紅亞甲藍(lán)平板，35℃培養(yǎng)18～24 h，觀察其菌落形態(tài)。陰性菌對(duì)照組:取金黃色葡萄球菌作為陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)菌，方法同實(shí)驗(yàn)組。

常規(guī)法實(shí)驗(yàn)結(jié)果:經(jīng)膽鹽乳糖培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)組有明顯產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象，檢出大腸埃希菌，而陰性對(duì)照組未檢出大腸埃希菌。結(jié)果表明采用常規(guī)法進(jìn)行大腸埃希菌檢驗(yàn)，方法成立。見表4。

表4 大腸埃希菌檢查常規(guī)法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

使用常規(guī)法對(duì)稀釋劑進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果5種實(shí)驗(yàn)菌株的回收率均＞70%，表明稀釋劑pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液無抑菌作用，對(duì)實(shí)驗(yàn)無干擾。薄膜過濾法另設(shè)的稀釋劑對(duì)照組，其3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)稀釋劑對(duì)照組回收率(稀釋劑對(duì)照組平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率)均＞70%，同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的菌數(shù)回收率均＞70%，證明采用薄膜過濾法(每個(gè)平皿沖洗量300 mL)可有效消除供試品的抑菌作用，并且證明該驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。

經(jīng)方法驗(yàn)證生產(chǎn)企業(yè)在原、輔料、生產(chǎn)和檢驗(yàn)等條件不變的情況下，乳核內(nèi)消液的微生物限度檢查方法:細(xì)菌計(jì)數(shù)方法為薄膜過濾法(每個(gè)平皿沖洗量300 mL)，真菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法為常規(guī)法，控制菌大腸埃希菌檢查采用常規(guī)法。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄79.

［2］ 顏棟林，李萍，蘭茜.柴黃片微生物限度檢查法方法驗(yàn)證［J］.中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2009，16(16):7-8.

［3］ 張廣求.十九味赤芍膠囊微生物限度檢查方法的建立［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，28(8):1075-1076.

［4］ 張麗梅，李俊，邢建華.抗生丸微生物限度檢查法的驗(yàn)證［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，28(6):792-793.